Цитогенетический метод исследования в медицинской генетике. Медицинская биология. Задания для самостоятельной работы

Для качественной своевременной диагностики врожденных заболеваний, предрасположенности к онкологическим патологиям используется цитогенетическое исследование.

С помощью современных методик и новейшего оборудования изучается хромосомный набор плода.

Найденные аномалии в хромосомном аппарате позволят выявить и предотвратить возможные патологии еще до рождения ребенка.

Данная процедура отличается сложностью и многоступенчатостью, поэтому для решения каждой отдельной диагностической задачи требуется свое цитогенетическое специализированное обследование.

Цитогенетическое исследование изучает связи между наследственными факторами и ядерными структурами соматических клеток человека.

Данные методы анализа широко используются в биологии и медицине для определения происхождения, эволюции, изменчивости живых существ на протяжении филогенеза и онтогенеза.

Особое внимание уделяется индивидуальным генетическим особенностям. Именно поэтому главным предметом, с которым работает цитогенетический метод исследования, является хромосомный набор человека, животных и растений.

Изменения в хромосомах, передаваясь по наследству, определяют признаки организма, его подверженность различным заболеваниям, устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды.

Именно хромосомы определяют передачу некоторых заболеваний, поэтому по их набору и структурным изменениям можно увидеть предрасположенность конкретного человека к развитию онкологических и других тяжелых болезней.

Разнообразные структурные перестройки хромосом, аномалии хромосомного набора выявляет цитогенетический анализ и исследование.

Такие методики применяются для современной диагностики опасных заболеваний на начальных стадиях их развития.

На ранних стадиях беременности применение цитогенетического исследования хромосом плода позволяет определить пол будущего ребенка на клеточном уровне.

Высокотехнологичное оборудование последнего поколения, проверенные методики исследования позволяют обнаруживать и предотвращать онкологические заболевания и генетические патологии.

Точная диагностика дает возможность определить наиболее оптимальную тактику лечения, которая будет способствовать положительному терапевтическому результату.

Успешность такой процедуры зависит от качества, точности оборудования, квалификации, опыта медицинского персонала.

Точные данные анализа хромосом определяют успешность всего последующего лечения, поэтому необходимо стараться с первого раза получить правильные результаты.

Иногда данный вид диагностики оказывается единственно возможным. Эта технология исследования позволяет создать большое количество копий ДНК, которые исследуются различными способами, повышая достоверность результатов.

Выявленная на ранних стадиях болезнь лечится намного легче, а эффективная быстрая терапия зачастую спасает жизнь.

Исследование кариотип

Хромосомный набор (кариотип) изучается несколькими способами, которые используют различный биологический материал для анализов.

Исследование кариотип чаще всего работает с венозной кровью, которая смешивается в пробирке с литием и гепарином.

Забор крови производится в количестве 2 мл, после чего она содержится внутри питательной среды на протяжении 3 суток. Только после этого полученный материал фиксируется и исследуется под микроскопом.

За месяц до анализа хромосом следует отказаться от приема антибиотиков, кроме того, такие процедуры не проводятся при простудных заболеваниях.

Исследования кариотипа (кариотипирование) анализирует с помощью методики световой микроскопии форму, размер, число хромосом, используя специальное окрашивание. Нормальные показатели у мужчин обозначаются 46,XY, а у женщин – 46,XX.

Кариотипирование исследует структурные аномалии генетического материала, которые связаны с разрывами хромосом. Эти разрушения компенсируются с помощью различных нездоровых аномальных комбинаций.

С развитием современной медицинской техники появляются новые цитогенетические методики исследования, которые эффективно идентифицируют такие патологические изменения хромосом.

Если существуют подозрения на генетические отклонения в развитии эмбриона человека, то отдельно производится цитологический анализ плода.

Современные медицинские центры с хорошим оборудованием и квалифицированным персоналом выявляют различные пороки развития, хромосомные болезни, с достаточно высокой точностью определяют возможности благополучно выносить ребенка.

Если есть подозрения на онкологические заболевания органов системы кроветворения, то назначается цитологическое исследование костного мозга.

Такие анализы проводятся только в медицинских учреждениях, которые имеют специальное оборудование и квалифицированный персонал.

Это вызвано тем, что забор биологического материала для анализа и исследования связан с опасностью для здоровья и жизни.

С целью исключения хромосомных заболеваний плода на 3-4 месяце беременности проводится анализ хориона, который исследует не менее 20 клеток системы кроветворения.

Такое тестирование поможет предвидеть такие патологии, как болезнь Хантера, синдром Дауна и многие другие заболевания.

Изменение набора хромосом при онкологических процессах может быть использовано для ранней диагностики рака, поэтому диагностические исследования на цитологическом уровне активно развиваются с ростом технического прогресса.

Задачи анализа кариотипа и его виды

Подробное изучение кариотипа проводится для решения следующих конкретных задач:

• уточнения диагностического основания для назначения оптимального лечения онкологических заболеваний;
• выявления причины врожденных заболеваний ребенка на генетическом уровне;
• нахождение генетических причин выкидыша, женского бесплодия;
• выявление последствий воздействия вредных факторов на работе;
• обнаружения аномальных хромосом у плода.

Таким образом, показаниями к проведению подобного анализа являются бесплодие, прерывание беременности, подозрение на хромосомные патологии, отсутствие менструаций у женщин половозрелого возраста, нарушения и задержки полового развития.

Хромосомные аномалии у плода нередко могут становиться причиной неразвивающейся беременности.

В зависимости от уровней проведения анализ кариотипа бывает двух видов:

• обычным;
• молекулярным.

Если нарушение нормального кариотипа происходит на ранних стадиях полового развития человека, то при слиянии половых клеток и образовании зиготы такие аномалии сохраняются.

В дальнейшем развитии эмбрион сохраняет патологические неправильные хромосомы. Такое положение приводит к патологическим изменениям индивидуального развития, которые нередко оказываются нежизнеспособными.

Однако бывает положение, когда изначально при делении зиготы развивается несколько линий делений клеток, которые имеют разные кариотипы. Это позволяют выявить обычные цитогенетические методы исследования.

Молекулярное кариотипирование является самым современным методом исследования генома человека. С помощью такого анализа появилась возможность выявлять различные вариации числа копий генов.

Такие патологии характеризуются потерями участков молекул ДНК, которые содержат важную генетическую информацию. Все это приводит к умственной отсталости, эпилепсии, раку, аутизму.

С помощью этого метода можно достаточно точно определить гены, которые находятся в области перестройки, выяснить их непрямой или непосредственный вклад на развитие генетических заболеваний.

На сегодняшний день этот метод является важнейшим инструментом для постановки точного диагноза большинства генетических патологий.

Процедура кариотипирования

Набор внутри соматических клеток организма, состоящий из 23 пар хромосом, одна из которых передается от матери, а другая – от отца, представляет собой кариотип человека.

Для проведения анализа кариотипа используются любые клетки, которые могут быть получены из крови, костного мозга, эпителия человека.

На протяжении клеточного цикла внешний вид хромосом значительно меняется. На одних стадиях митоза они располагаются внутри ядра, не имеют спиральной формы, а на других образуется спиральная структура большего размера.

Наиболее подходящий для внешнего наблюдения этап клеточного деления – метафаза. Именно на этой стадии можно проводить микроскопическое исследование хромосом.

Исследовательская процедура проводится в следующем порядке:

1. Митоз останавливается на стадии метафазы и с помощью добавления колхицина, который фиксирует незаконченный процесс деления клеток, выделенная клеточная структура обогащается;
2. Такие клетки окрашиваются, фиксируются, после чего их фотографируют под микроскопом;
3. Полученные фотографии гомологичных хромосом систематизируются и выкладываются в определенном порядке.

С появлением методов дифференциальной окраски хромосом стала возможна их более подробная детализация при микроскопическом исследовании. Со временем эта методология совершенствовалась и развивалась.

Сдать анализ на определение кариотипа можно во многих специализированных клиниках. При этом такая процедура может проводиться в двух вариантах.

В первом случае анализируются количественные и структурные изменения хромосом, полученных от родителей.

Во втором анализируются внутренние мутации хромосом под влиянием неблагоприятных внешних факторов.

Нередко кариотипирование назначается супругам для определения причин бесплодия. При этом сдача биологического материала на анализ может происходить в разное время.

Таким образом, анализ кариотипов имеет большое значение в медицине, поскольку позволяет определять хромосомные перестройки, нарушения их структуры и порядка.

Цитогенетические обследования диагностируют ряд генетических заболеваний, которые напрямую связаны с хромосомами.

Цитогенетические исследования - это совокупность методов исследования связи между явлением наследственности и строением клеток (особенно структур клеточного ядра). Цитогенетические исследования играют важную роль в медико-биологических работах, так как с их помощью выясняют генетические особенности, изменчивость (см.), происхождение и эволюцию живых существ.

Объектом цитогенетических исследований служат в первую очередь (см.) человека, животных и растений, имеющие специфические для каждого вида свойства (количество, размеры, особенности строения) и образующие характерный для данного организма кариотип. Поэтому методы цитогенетических исследований используются при построении естественных классификаций живых организмов.

В цитогенетических исследованиях уделяют особое внимание полиплоидии - явлению, связанному с кратным увеличением числа хромосом, сопровождающимся появлением целого ряда новых свойств (увеличение общих размеров, вкусовых качеств фруктов и овощей, жизнестойкости у растений и т. д.). Разработка проблемы полиплоидии имеет практическое значение в , в селекции растений и животных.

С помощью цитогенетических исследований обнаруживают изменения в хромосомах, передающиеся потомству и определенным образом влияющие на признаки организма. Изучают вредные хромосомные перестройки, утрату, выпадение или добавление отдельных хромосом или участков хромосом. Они позволяют выявить участие наследственного фактора в возникновении ряда заболеваний человека (см. Наследственные болезни), в том числе нарушений развития, предрасположенность к злокачественным новообразованиям и т. д. Цитогенетические исследования привели к правильному пониманию природы .

С помощью цитогенетических исследований установлено, например, что в ядрах клеток различных тканей и органов, но только у самок, присутствуют интенсивно окрашиваемые специальными красителями образования, так называемые тельца Барра или (см.). Оказалось, что половой хроматин встречается у многих животных и у человека. Открытие полового хроматина позволило определять человека на клеточном уровне (это имеет особое значение для судебной медицины), диагностировать пол на ранних стадиях беременности и решать ряд других вопросов медицинской практики.

См. также Генетика, Наследственность.

Цитогенетические исследования - микроскопическое изучение особых структур клетки, обусловливающих процессы наследования и развития.

Цитогенетические исследования получают все более широкое применение в клинической медицине. Наиболее простым, быстрым и доступным методом цитогенетического анализа является исследование полового хроматина.

Половой хроматин представляет собой хроматиновое тельце, которое отсутствует у особей мужского пола, а у особей женского пола прилежит к ядерной оболочке.

Таким образом, это тельце может служить цитологическим признаком пола, в связи с чем оно и получило название половой хроматин.

Размеры телец полового хроматина у человека колеблются от 0,7 до 1,2 мк, форма их может варьировать (рис. 1 - 3). У женщин половой хроматин определяется в среднем в 40% ядер (рис. 4). Он образуется одной из Х-хромосом женского кариотипа, находящейся в неактивном, спирализованном состоянии. Половой хроматин можно определить в клетках слизистой оболочки полости рта, влагалища и мочеиспускательного канала, а также в клетках крови, биопсированной кожи, культивируемой ткани взрослого, в эмбриональной ткани, нервных клетках.

Наиболее простая и удобная методика определения полового хроматина в клетках слизистой оболочки полости рта предложена Тири (Н. Thiries) и усовершенствована Сандерсоном (S. Sanderson). Для исследования берут соскоб со слизистой оболочки щек. Материал переносят на предметное стекло, высушивают на воздухе и в течение 10 мин. фиксируют в метиловом спирте. Окраску производят каплей свежефильтрованного ацетоорсеина (1 г синтетического орсеина растворяют в 45 мл ледяной уксусной кислоты, подогревают до кипения и после охлаждения фильтруют, к 45 мл профильтрованного раствора добавляют 55 мл дистиллированной воды и эту смесь фильтруют повторно). При микроскопировании иммерсионным объективом подсчитывают количество хроматинположительных ядер на 100 клеток.

Исследование полового хроматина применяют для цитологического определения пола, быстрой и ранней диагностики заболеваний, связанных с аберрациями половых хромосом (в частности, синдромов Клайнфелтера, Шерешевского-Тернера и др.), характеристики ряда физиологических процессов (в частности, менструального цикла), исследования общих и локальных закономерностей ряда патологических процессов и прежде всего злокачественных новообразований, выяснения действия некоторых терапевтических методов и средств (антибиотиков, кортикостероидов, цитостатических препаратов).

К методам цитогенетического анализа относится также изучение кариотипа (см.).

Установлено, что хромосомный набор человека состоит из 46 хромосом (23 пары), двух половых хромосом (XX - у женщины, XY - у мужчины), 22 пар аутосом (рис. 5) и отличается высоким постоянством в клетках человеческого организма.

В зависимости от длины хромосом и расположения их центромер весь хромосомный набор делится на 7 групп - А, В, С, D, Е, F, G.

Для изучения хромосомного набора человека (кариотипа) используют методы культивирования лейкоцитов периферической крови, фибробластов эмбриональной ткани, культивирование клеток кожи и прямой метод определения хромосомного набора в клетках костного мозга.

Впервые об успешном культивировании неделящихся лейкоцитов сообщил советский биолог Г. К. Хрущев (1935). В 1958 г. Ноуэлл (P. Nowell) предложил использовать для стимуляции деления лейкоцитов вещество, выделенное из бобовых растений,- фитогемагглютинин (ФГА). Культивирование лейкоцитов осуществляют по модифицированной и усовершенствованной методике. 10 мл венозной крови, взятой стерильно в пробирку с гепарином (1 мл ампулированного гепарина разводят в 20 раз раствором Хенкса), помещают на 30-40 мин. в холодильник. Затем стерильно (в боксе) в кровь добавляют 0,7 - 1 мл 10% раствора желатины для ускорения осаждения эритроцитов. После отстаивания крови плазму отсасывают и помещают в стерильную колбу. К плазме добавляют среду 199 либо среду Игла из расчета 1,5 мл среды на 1 мл плазмы.

Для стимуляции митотической активности лейкоцитов в смесь добавляют 0,2 мл ФГА. Полученную клеточную суспензию помещают в термостат при t° 37° на 72 часа. За 2-3 часа до проведения фиксации на каждый флакон (суспензия для культивирования разливается по 1,5-2 мл в стерильные флаконы типа пенициллиновых) добавляют по 0,5-0,75 мкг колхицина (рабочий раствор колхицина: 10 мкг на 1 мл дистиллированной воды) и продолжают культивирование. В дальнейшем культуры центрифугируют в течение 5 мин. при 800 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, к ней добавляют 3-5 мл 0,95% раствора цитрата натрия, нагретого до t°37°, который вызывает набухание клеток. В гипотоническом растворе клетки находятся от 15 до 30 мин., после чего надосадочную жидкость сливают, к осадку осторожно добавляют фиксатор (3 ч. абсолютного спирта + 1 ч. ледяной уксусной кислоты), ставят в холодильник на 15 мин., затем повторно центрифугируют и меняют фиксатор. На обезжиренные предметные стекла наносят 1-2 капли клеточной суспензии и высушивают над пламенем либо поджигают фиксатор («жженые» препараты). Препараты красят полихромной синью Унны, ацетоорсеином или по Романовскому. Хромосомный набор изучают при помощи иммерсионной микроскопии в 100 метафазных пластинах.

Для изучения хромосом используют также прямой метод определения хромосомного набора в клетках костного мозга: 1 мл свежеаспирированного пунктата костного мозга помещают в колбу с 30 мл среды 199 и 3 мл раствора колхицина (10 мкг на 1 мл). Содержимое колбы осторожно взбалтывают для равномерного распределения клеток, а затем центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают и к осадку добавляют 10 мл 0,95% раствора цитрата натрия, подогретого до t° 37°. Клетки тщательно ресуспензируют и помещают в термостат при t° 37° на 40-45 мин. После этого вновь проводят центрифугирование, надосадочную жидкость сливают и к осадку добавляют свежеприготовленный фиксатор, состоящий из 3 ч. метилового спирта и 1 ч. концентрированной уксусной кислоты. Через 10 мин. осадок ресуспензируют и оставляют в фиксаторе еще на 20 мин. при комнатной температуре, затем центрифугируют в течение 10 мин., вновь меняют фиксатор и приготовляют препараты тем же способом, как при фиксации культуры лейкоцитов крови.

Исследование кариотипа может быть с успехом использовано для диагностики хромосомных заболеваний человека. За последнее время выделена целая группа хромосомных болезней, связанных с патологией как половых, так и аутосомных хромосом (см. Наследственные болезни). Помимо изменения количества хромосом, возможно нарушение их морфологии. Так, при хроническом миелоидном лейкозе наблюдается необычно малая акроцентрическая хромосома из 21-й пары. Появление анеуплоидии (увеличение или уменьшение числа хромосом, некратное гаплоидному числу хромосом) может служить прогностическим тестом для терминальной стадии лейкоза.

Цитогенетические исследования все ближе смыкаются с онкологическими. Возможно, что изменения хромосомного набора при раковых процессах можно будет использовать для их ранней диагностики. Для цитогенетических исследований используют методы кратковременных тканевых культур: метод плазменного сгустка с последующим исследованием субкультур и метод первично трипсинизированных суспензионных культур. Предпочтение следует отдать первому методу, так как второй требует большого количества ткани для получения суспензии клеток, способных к размножению.

Для создания наиболее благоприятных условий метаболизма используют плацентарную сыворотку человека, не обладающую токсичностью, 50% эмбриональный экстракт абортированных плодов человека, который готовят на среде Игла. Для закрепления кусочков на стекле и прикрепления большего числа клеток при применении суспензионных культур используют сухую человеческую плазму IV группы, разведенную перед употреблением средой Игла и плацентарной сывороткой 1:1; после внесения эксплантата добавляют эмбриональный экстракт. Культивирование проводят во флаконах Карреля (см. Культура тканей).

Рис. 1. Половой хроматин в виде овала (Х1100).
Рис. 2. Половой хроматин в виде треугольника (XI100).
Рис. 3. Половой хроматин в виде утолщения ядерной оболочки (Х1100).
Рис. 4. Хроматинотрицательное ядро у женщины (Х1100).
Рис. 5. Нормальный женский кариотип (x1100).

Цитогенетический метод

Основан на изучении хромосом человека в норме и при патологии. В норме кариотип человека включает 46 хромосом - 22 пары аутосом и две половые хромосомы. Использование данного метода позволило выявить группу болезней, связанных либо с изменением числа хромосом, либо с изменениями их структуры. Такие болезни получили название хромосомных.

Материалом для кариотипического анализа чаще всего являются лимфоциты крови. Кровь берется у взрослых из вены, у новорожденных - из пальца, мочки уха или пятки. Лимфоциты культивируются в особой питательной среде, в состав которой, в частности, добавлены вещества, «заставляющие» лимфоциты интенсивно делиться митозом. Через некоторое время в культуру клеток добавляют колхицин. Колхицин останавливает митоз на уровне метафазы. Именно во время метафазы хромосомы являются наиболее конденсированными. Далее клетки переносятся на предметные стекла, сушатся и окрашиваются различными красителями. Окраска может быть а) рутинной (хромосомы окрашиваются равномерно), б) дифференциальной (хромосомы приобретают поперечную исчерченность, причем каждая хромосома имеет индивидуальный рисунок). Рутинная окраска позволяет выявить геномные мутации, определить групповую принадлежность хромосомы, узнать, в какой группе изменилось число хромосом. Дифференциальная окраска позволяет выявить хромосомные мутации, определить хромосому до номера, выяснить вид хромосомной мутации.

В тех случаях, когда необходимо провести кариотипический анализ плода, для культивирования берутся клетки амниотической (околоплодной) жидкости - смесь фибробластоподобных и эпителиальных клеток.

К числу хромосомных заболеваний относятся: синдром Клайнфельтера, синдром Тернера-Шерешевского, синдром Дауна, синдром Патау, синдром Эдвардса и другие.

Больные с синдромом Клайнфельтера (47, ХХY) всегда мужчины. Они характеризуются недоразвитием половых желез, дегенерацией семенных канальцев, часто умственной отсталостью, высоким ростом (за счет непропорционально длинных ног).

Синдром Тернера-Шерешевского (45, Х0) наблюдается у женщин. Он проявляется в замедлении полового созревания, недоразвитии половых желез, аменорее (отсутствии менструаций), бесплодии. Женщины с синдромом Тернера-Шерешевского имеют малый рост, тело диспропорционально - более развита верхняя часть тела, плечи широкие, таз узкий - нижние конечности укорочены, шея короткая со складками, «монголоидный» разрез глаз и ряд других признаков.

Синдром Дауна - одна из самых часто встречающихся хромосомных болезней. Она развивается в результате трисомии по 21 хромосоме (47; 21, 21, 21). Болезнь легко диагностируется, так как имеет ряд характерных признаков: укороченные конечности, маленький череп, плоское, широкое переносье, узкие глазные щели с косым разрезом, наличие складки верхнего века, психическая отсталость. Часто наблюдаются и нарушения строения внутренних органов.

Хромосомные болезни возникают и в результате изменения самих хромосом. Так, делеция р-плеча аутосомы №5 приводит к развитию синдрома «крик кошки». У детей с этим синдромом нарушается строение гортани, и они в раннем детстве имеют своеобразный «мяукающий» тембр голоса. Кроме того, наблюдается отсталость психомоторного развития и слабоумие.

Чаще всего хромосомные болезни являются результатом мутаций, произошедших в половых клетках одного из родителей.

Биохимический метод

Позволяет обнаружить нарушения в обмене веществ, вызванные изменением генов и, как следствие, изменением активности различных ферментов. Наследственные болезни обмена веществ подразделяются на болезни углеводного обмена (сахарный диабет), обмена аминокислот, липидов, минералов и др.

Фенилкетонурия относится к болезням аминокислотного обмена. Блокируется превращение незаменимой аминокислоты фенилаланин в тирозин, при этом фенилаланин превращается в фенилпировиноградную кислоту, которая выводится с мочой. Заболевание приводит к быстрому развитию слабоумия у детей. Ранняя диагностика и диета позволяют приостановить развитие заболевания.

42. Пренатальная диагностика врожденных и наследственных болезней - это комплексная отрасль медицины, которая быстро развивается. Она использует и ультразвуковую диагностику (УЗИ), и оперативную технику (хорионбиопсию, амнио-и кордоцентез, биопсию мышц и кожи плода), и лабораторные методы (цитогенетические, биохимические, молекулярно-генетические).

Пренатальная диагностика имеет исключительно важное значение при медико-генетическом консультировании, поскольку она позволяет перейти от вероятного к однозначному прогнозированию здоровья ребенка в семьях с генетическими осложнениями. В настоящее время пренатальная диагностика осуществляется в I и II триместрах беременности, то есть в периоды, когда в случае выявления патологии еще можно прервать беременность. На сегодня возможна диагностика практически всех хромосомных синдромов и около 100 наследственных болезней, биохимический дефект при которых установлен достоверно.

Пренатальная диагностика - комплексная дородовая диагностика с целью обнаружения патологии на стадии внутриутробного развития. Позволяет обнаружить более 98 % плодов с синдромом Дауна (трисомия 21); трисомии 18 (известной как синдром Эдвардса) около 99,9 %; трисомии 13 (синдром Патау) около 99.9%, более 40 % нарушений развития сердца и др. В случае наличия у плода болезни родители при помощи врача-консультанта тщательно взвешивают возможности современной медицины и свои собственные в плане реабилитации ребёнка. В результате семья принимает решение о судьбе данного ребёнка и решает вопрос о продолжении вынашивания или о прерывании беременности.

К пренатальной диагностике относится и определение отцовства на ранних сроках беременности, а также определение пола плода.

Показания для пренатальной диагностики : наличие в семье наследственного заболевания; возраст матери старше 37 лет; носительство матерью гена Х-сцепленного рецессивного заболевания; наличие в прошлом спонтанных абортов в ранние сроки беременности, мертворождений, детей с пороками развития, хромосомной патологией; наличие структурных перестроек хромосом у одного из родителей; гетерозиготность обоих родителей по одной паре аллелей при патологии с аутосомно-рецессивным типом наследования; зона повышенного радиационного фона.

В настоящее время применяются непрямые и прямые методы пренатальной диагностики. При непрямых методах обследуют беременную (акушерско-гинекологические методы, сыворотка крови на альфа-фетопротеин), при прямых - плод.

К прямым методам, которые проходят без нарушения тканей, без хирургического вмешательства относится ультрасонография. К прямым методом, которые проходят с с нарушением целостности тканей – хорионбиопсия, амниоцентез, кордоцентез и фетоскопия.

Ультрасонография, эхография – это использование ультразвука для получения изображения плода и его оболочек, состояния плаценты.

На 5-й неделе беременности уже можно получить изображение оболочек эмбриона, к концу 6-й недели можно зарегистрировать его сердечную деятельность, а на 7-й неделе можно получить изображение и самого будущего ребенка.

В первые два месяца беременности УЗИ еще не позволяет выявить аномалии развития плода, но может определить его жизнеспособность. На 12 - 20-й неделе беременности уже возможна диагностика близнецовой беременности, локализации плаценты, отсутствия головного или спинного мозга, дефектов костной системы, закрытия невральной трубки, заращение естественных каналов желудочно-кишечного тракта.

Метод безопасен, поэтому продолжительность исследования не ограничена, и его можно применять повторно. При нормальном течении беременности проводят двукратное УЗИ, а при беременности с риском осложнений оно проводится с интервалами в 2 недели.

УЗИ плода обязательно при: наличии у родителей и ближайших родственников врожденных пороков развития; экстрагенитальных заболеваниях у беременной, например, гипертонической болезни, сахарного диабета, тиреотоксикоза, порока сердца, ожирения и др.; наличии мертворожденных детей, перинатальной смерти двух и более детей; угрозе прерывания беременности, кровотечении; недостаточной прибавке массы тела беременной; несоответствии размеров матки сроку беременности; многоплодии; фибромиоме матки.

В целом УЗИ позволяет получить данные о размерах плода (длина туловища, бедра, плеча, диаметр головы), о наличии у него дисморфии, о работе сердца, об объеме жидкости в зародышевой оболочке и размерах плаценты.

УЗИ позволяет обнаружить у плода и некоторые пороки развития. Например, отсутствие головного и спинного мозга, чрезмерное количество спинномозговой жидкости в полости черепа, аномалии структуры почек, неправильное развитие конечностей, легких, множественные врожденные пороки, пороки сердца, отек плода и плаценты.

Эхографияплаценты позволяет установить ее расположение, наличие отслойки ее отдельных участков, кисты, признаки старения, истончение или утолщение плаценты.

Допплеровское ультразвуковое сканирование, цветная допплерометрия отражают кровообращение плода.

ЯМР-томография плода позволяет выявить структурные аномалии, не обнаруживаемые при УЗИ, например, малые аномалии мозга, туберозный склероз, аномалии структуры почек и др.

Часто используют три метода исследования: уровня альфа-фетопротеина (особый эмбриональный белок), содержания хорионического гонадотропина (гормон, вырабатываемый плацентой в период беременности) и свободного эстриола (женский половой гормон) в крови женщины во 2-м триместре беременности. Отклонения этих показателей от нормы служат индикаторами высокого риска для плода.

Содержание альфа-фетопротеина в биологических жидкостях повышено при множественных пороках развития плода, спинномозговой грыже, чрезмерном количестве спинномозговой жидкости в области черепа, отсутствии головного или спинного мозга, пороках развития желудочно-кишечного тракта, дефектах передней брюшной стенки, аномалиях почек, фетоплацентарной недостаточности (недостаточной работе плаценты), задержке развития плода, многоплодной беременности, преэклампсии, резус-конфликте, вирусном гепатите В.

Концентрация альфа-фетопротеина в крови беременной снижена в случаях хромосомных болезней у плода, например, болезни Дауна, или наличия у беременной сахарного диабета I типа.

В настоящее время исследование альфа-фетопротеина проводится в 1-м триместре беременности одновременно с определением специфического для беременных белка А, что позволяет диагностировать болезнь Дауна и некоторые другие хромосомные аномалии у плода уже на 11 - 13-й неделях.

Хорионический гонадотропин (ХГ) определяется уже на 8 - 9-й дни после зачатия. При исследовании крови женщины во 2-м триместре беременности повышение уровня ХГ свидетельствует о задержке внутриутробного развития плода, высоком риске его гибели, отслойке плаценты, и о других видах фетоплацентарной недостаточности (нарушение работы плаценты).

Исследование уровня белка беременности I (Schwangerschaft protein I) в плазме крови женщин уже в 1-м триместре беременности служит индикатором хромосомных болезней плода.

Хорионбиопсия – это взятие ткани хориона (зародышевая оболочка). Проводится между 8-й и 10-й неделями. Ткань используется для цитогенетических и биохимических исследований, анализа ДНК. С помощью этого метода можно выявлять все виды мутаций (генные, хромосомные и геномные).

Значительным преимуществом хорионбиопсии является то, что она может быть использована на ранних этапах развития плода. Т. е. если выявятся отклонения в развитии плода и родители решат прервать беременность, то аборт на 10 – 12 неделе менее опасен, чем на 18 - 20-й неделе, когда становятся известны результаты амниоцентеза.

Амниоцентез – получение амниотической жидкости (жидкость вокруг зародыша) и клеток плода для анализа. Получение материала возможно на 16-й неделе беременности.

Основные показания для амниоцентеза общие: возраст беременной более 35 лет;нарушения нормы уровней альфа-фетопротеина, хорионичеокого гонадотропина и свободного эстриола в крови беременной;наличие нескольких серьезных факторов риска осложнений беременности.

Отдельные: мертворождения, перинатальная смертность;рождение предыдущего ребенка с хромосомными болезнями или с дисморфическими признаками;хромосомный сбалансированный мозаицизм у родителей;синдром ломкой Х-хромосомы у ближайших родственников;определение пола плода при риске наследственных Х-сцепленных заболеваний (гемофилия, иммунодефицит и др.);наследственные болезни обмена веществ;воздействие тератогенных агентов на организм беременной в критические периоды развития плода;задержка внутриутробного развития и дисморфия плода по данным УЗИ;риск внутриутробных инфекций (краснуха, цитомегалия, токсоплазмоз).

Осложнения при этом методе исследования не превышают 1 %.

Амниотическая жидкость используется для биохимических исследований, которые выявляют генные мутации. А клетки используются для анализа ДНК (выявляет генные мутации), цитогенетического анализа и выявления Х- и Y-хроматина (диагностирует геномные и хромосомные мутации).

Биохимические исследования амниотической жидкости могут дать ценную информацию. Например, диагностика адреногенитального синдрома (нарушения синтеза гормонов корой надпочечников и работы системы гипаталамус - гипофиз – яичники) у эмбриона возможна уже на 8-й неделе.

Исследование спектра аминокислот амниотической жидкости позволяет выявить некоторые наследственные болезни обмена веществ у плода, например, аргинин-янтарную ацидурию, цитруллинурию и др.

Исследование амниотической жидкости применяется для выявления хромосомных отклонений от нормы, определения активности ферментов.

Кордоцентез – взятие крови из пуповины. Материал используется для цитогенетических, молекулярно-генетических и биохимических исследований. Проводится с 18-й по 22-ю неделю.

Преимущество кордоцентеза по сравнению с амниоцентезом заключается в том, что берется кровь плода, что имеет решающее значение для диагностики внутриутробных инфекций, например, ВИЧ, краснухи, цитомегалии, парвовируса В19.

Однако показания для проведения кордоцентеза ограничены в связи с высоким риском осложнений, таких как внутриутробная гибель плода (до 6 %), недонашивание беременности (9 %).

Фетоскопия - осмотр плода фиброоптическим эндоскопом, введенным в зародышевую оболочку через переднюю стенку матки. Метод позволяет осмотреть плод, пуповину, плаценту и произвести биопсию.

Фетоскопия имеет очень ограниченное применение, т. к. сопровождается высоким риском прерывания беременности и технически сложна.

Современные технологии позволяют осуществлять биопсию кожи, мышц, печени плода. Материал используется для диагностики тяжелых наследственных заболеваний, например, генодерматозов, мышечных дистрофий, гликогенозов и др.

Риск прерывания беременности при применении методов пренатальной диагностики, нарушающих целостность тканей, составляет 1 - 2%.

Везикоцентез – прокол стенки мочевого пузыря плода для получения его мочи. Материал используется для исследования в случаях серьезных заболеваний и пороков развития органов мочевой системы.

Доимплантационная диагностика наследственных болезней стала возможной благодаря появлению экстракорпорального оплодотворения и использованию множественных копий эмбриональной ДНК.

Существует технология для выявления таких болезней, как Тея-Сакса, гемофилия, миодистрофия Дюшенна, фрагильная Х-хромосома и др. Однако она доступна немногим очень крупным центрам и дорого стоит.

Разрабатываются методы выделения клеток плода, циркулирующих в крови беременной, для проведения цитогенетических, молекулярно-генетических и иммунологических анализов.

Развитие и распространение методов пренатальной диагностики наследственных заболеваний позволят значительно снизить частоту наследственной патологии новорожденных.

Метод позволяет идентифицировать кариотип (особенность строения и число хромосом), путем записи кариограммы. Цитогенетическое исследование проводится у пробанда, его родителей, родственников или плода при подозрении на хромосомный синдром либо другое хромосомное нарушение.

Для определения кариотипа используют как прямые, так и непрямые методы исследования. В первом случае материал, взятый из костного мозга, лимфатических узлов, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости или других тканей, изучают сразу же после получения. Однако прямой метод информативен только тогда, когда в материале имеется достаточное количество метафаз митоза, так как только в этой фазе хромосомы приобретают присущие им особенности строения и возможна их точная идентификация. В настоящее время широко применяются непрямые методы исследования.

Метод приготовления метафазных пластин. Взятую культуру (лимфоциты периферической крови и др.) помещают в питательную среду для культивирования. В норме в периферической крови не наблюдается митоза лимфоцитов, поэтому используют препараты (фитогемагглютинин), стимулирующие иммунологическую трансформацию лимфоцитов и их деление. Вторым этапом является остановка митотического деления клетки на стадии метафазы. Достигается это путем добавления в культуру тканей за 2-3 часа до окончания культивирования препаратов колхицин или колцимед. На третьем этапе, используя гипотонический раствор хлорида кальция или цитрат натрия, добиваются гипотонизации клеток, в результате чего клетка набухает, ядерная оболочка разрывается, межхромосомные связи рвутся, и хромосомы свободно плавают в цитоплазме. Далее полученная культура фиксируется смесью метанола и уксусной кислоты, центрифугируется и меняется фиксатор. Суспензия с фиксатором наносится на чистое предметное стекло, где метафазная пластинка расправляется и в ее пределах располагаются отдельно лежащие хромосомы. По мере высыхания фиксатора, клетка прочно прикрепляется к стеклу. Таким образом, независимо от культуры клеток, из которых были получены метафазные пластинки общий принцип получения препаратов следующий: накопление метафаз, гипотонизация, фиксация, раскапывание на предметное стекло.

Окраска препарата. Окраска препаратов является следующей стадией после получения метафазных пластин и делится на простые, дифференцированные и флюоресцентные. Каждая из видов окрашивания применяется для выявления только определенных изменений кариотипа. При простой окраске (метод окраски по Гимзе), возможно лишь групповая идентификация хромосом, поэтому данный метод используется для ориентировочного определения числовых аномалий кариотипа. Простая окраска широко применяется для изучения хромосомного мутагенеза при проверке факторов окружающей среды на мутантность. Краситель Гимзы окрашивает все хромосомы равномерно по всей длине, контурируя при этом центромеру, спутники и вторичные перетяжки. Дифференциальное окрашивание обусловлено способностью к избирательному окрашиванию по длине и обеспечивается сравнительно простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы. При этом выявляется структурная дифференцировка хромосом по длине, выражающееся в виде чередования эу- и гетерохроматических районов (темные и светлые), которые специфичны для каждой хромосомы, соответствующего плеча и района. Наиболее часто используется G-окраска. При этом хромосомы предварительно обрабатываются протеазой или солевым раствором. Для изучения мутационного процесса у человека широко используется метод дифференциальной окраски сестринских хроматид, основанный на способности включатся в последовательность репликации хромосомы аналога тимидина-5-бромдезоксиуридина. Участки хромосомы, включившие этот аналог, окрашиваются плохо, поэтому используя этот метод можно идентифицировать любую хромосому или хромосомную перестройку.

Исследование полового хроматина. Метод определения полового хроматина быстрее и проще, чем исследование набора хромосом (кариотипа), поэтому он применяется в качестве одного из скрининг-тестов при массовых обследованиях населения. В норме в клетках женского организма при определенных способах окраски вблизи ядерной мембраны образуется интенсивно окрашиваемое тельце - половой хроматин, или тельце Барра, которое образуется одной, неактивной Х-хромосомой. Другая Х-хромосома в клетках женского организма является активной. У мужчин имеется лишь одна Х-хромосома, и она всегда активна, поэтому в ядрах клеток мужского организма половой хроматин не определяется. Для исследования полового хроматина Х обычно берут соскоб со слизистой полости рта. Наиболее распространен экспресс-метод окраски по Сандерсу с использованием 2% раствора уксуснокислого ацетоорсеина с последующей иммерсионной микроскопией. Кроме того, в зрелых нейтрофилах крови выявляется еще и так называемая барабанная палочка, причем телец хроматина и барабанных палочек на единицу меньше числа Х-хромосом. В нейтрофилах у мужчин выявляются также околоядерные образования в виде «ниточек» и «волосков». Исчезновение у женщин неактивной Х-хромосомы ведет к отсутствию полового хроматина. Появление у мужчины дополнительной Х-хромосомы приводит к формированию тельца полового хроматина.

Показания для цитогенетического обследования больного:

• 1) множественные пороки развития (с вовлечением трех и более систем); наиболее постоянные нарушения - пороки рзвития головного мозга, опорно-двигательной системы, сердца и мочеполовой системы;
• 2) умственная отсталость в сочетании с нарушениями физического развития, дисплазиями, гипогенитализмом;
• 3) стойкое первичное бесплодие у мужчин и у женщин при исключении гинекологической и урологической патологии;
• 4) привычное невынашивание беременности, особенно на ранних стадиях;
• 5) нарушение полового развития (гипогонадизм, половые инверсии);
• 6) небольшая масса ребенка, рожденного при доношенной беременности.

Применение цитогенетического метода в клинической генетике обусловило развитие нового направления - клинической цитогенетики, которая позволяет:

• - установить происхождение структурно перестроенных хромосом и их точную классификацию;
• - выделить синдромы, обусловленные дисбалансом по участкам индивидуальных хромосом;
• - накапливать сведения об изменениях хромосом в опухолевых клетках, у больных с наследственными заболеваниями крови и т.д.

Наследственность человека трудно поддается изучению:

Примерно одинаковая продолжительность жизни исследователя (врача) и пациента, максимально может изучит 3-4 поколения в семье,

Поздно наступающая половая зрелость человека и малое число потомков,

Большое число хромосом и генов,

Отсутствие записанных родословных в семье,

Гибридологический метод применять нельзя.

Существует ряд методов, которые позволяют проследить наследование признаков. Это позволяет установить диагноз, бороться с болезнями, провести консультацию лицам, нуждающимся в ней.

Клинико- генеалогический

Биохимический

Цитогенетический

Близнецовый

Популяционно-статестический

Имунно-генетический

Близнецовый метод.

МZ (ОБ) однояйцевые.

1 яйцеклетка + 1 сперматозоид → зигота, которая далее на ранних стадиях делиться на 2 эмбриона.

Всегда одного пола (генетически эдентичны). Различия между ними зависят в основном от действия внешних факторов.

2 яйцеклетка + 2 сперматозоида = → 2 зиготы.

DZ (РБ). Они сходны между собой как 2 сестры или 2 брата, рождённые порознь. Могут быть и разнополые или однополые. Различия зависят от наследственности и от средовых факторов.

Метод позволяет разграничить роль наследственности и среды в разнообразии признаков человека.

Если возникновение признака (или его отсутствие) в значительной степени зависит от генетической конструкции тогда у ОБ совпадение наблюдается чаще.

Внутрипарное сходство близнецов (похожесть) называется конкорданность, у ОБ она > чем РБ.

(псориаз МЗ 61 % РБ 13%) . Шизофрения 69% (10%). Депрессия (психоз) 96% (19%).

90-100% оттенок кожи, форма носа, оттенок радужки, у ОБ

Группа крови, слюны, резусу у ОБ- 100%

81-90% дактилоскоп. Узору у ОБ.

Сущность метода: изучения внутрипарного сходства близнецов, при сравнении которых можно судить о влиянии среды и наследственности на развитие того или иного признака (воздействие хим. в-в, лекарств…).

Цитогенетический метод.

Это микроскопический анализ хромосом (кариотипа) позволяет выявить числовые и структурные изменения хромосом (перестройки, поломки и др..

Хромосомы изучают в делящихся клетках костного мозга, лимфоцитах крови, реже кожи, мышц.

Хромосомы можно изучать и будущего ребёнка (эмбриона): ворсины хориона, клетки плаценты, пуповинной крови, амниотической жидкости (околоплодных вод- метод амниоцентез).

Клетки отбирают, выращивают на питательной среде, добавляют колхитин. Он останавливает митоз на стадии метафазы. Микропрепараты обязательно окрашивают. Существует различные методики цитогенетической диагностики. Методом можно определять половой хроматин (тельце Барра)

Показания к методу:

У пробанда, его родителей или родственников при подозрении на хромосомную болезнь (уточнение диагноза)

При тяжёлых психических расстройствах

При первичной аменореи (отсутствие менструации) бесплодии

При спонтанных абортах, мёртворожденных

У детей с множественными пороками развития, не подходящими под какую либо болезнь.

При изучении мутагенного действия, каких либо факторов (лекарственные средства, наркотики, радиация…)

При проведении медико- генетического консультирования.

Метод приводит к более точной диагностики, к своевременному лечению и предупреждению рождения больного ребёнка.