Определение времени свертывания плазмы крови. Основные тесты коагулограммы. Тесты смешивания плазмы крови больного с плазмой, имеющей заведомо известный дефицит того или иного фактора

Время свертывания цельной крови по Ли-Уайту
Контакт крови с поврежденной сосудистой стенкой или чужеродной поверхностью, замедление и остановка кровотока (стаз) приводят к последовательной активации звеньев гемостаза: адгезии и агрегации тромбоцитов, каскадной активации плазменных белковых факторов, формированию протромбиназы, образованию тромбина, а затем фибринового сгустка, изолирующего поврежденное место и способствующего ускорению регенеративных процессов.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Время свертывания крови - время образования сгустка свежевзятой нестабилизированной венозной крови в стеклянной пробирке.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Специальной подготовки пациента не требуется. Во избежание погрешностей в результатах теста при взятии венозной крови необходимо избегать массажа предплечья, немедленно расслабить жгут после появления крови и выпустить первые ее капли, содержащие фрагменты поврежденных тканей, на ватный/марлевый тампон.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
После обработки спиртом и высушивания области локтевого сгиба в локтевую вену вводят сухую широкую иглу без шприца.

В сухую стеклянную несиликонированную пробирку набирают 1 мл крови, запуская секундомер сразу при ее попадании. Исследование проводят при температуре 20-25 °С. Через 2 мин после взятия крови, а затем каждые 30 с пробирку осторожно наклоняют под углом 45-60° и определяют, растекается ли кровь по стенкам. Секундомер останавливают по завершении образования сгустка (кровь не переливается при наклоне пробирки).

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Время свертывания цельной крови при комнатной температуре - 6-11 мин. В связи со значительным влиянием интерферирующих факторов (температуры, состояния стенок пробирки и иглы, частоты и амплитуды наклона пробирки, объема крови и особенностей процедуры ее взятия) разброс результатов теста даже при точном соблюдении условий довольно велик. Тест ориентировочный, для него не существует калибровочных и контрольных материалов.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Возрастание времени свертывания крови свидетельствует о гипокоагуляционных сдвигах: выраженном дефиците фибриногена и плазменных факторов внутреннего пути гемостаза, действии антикоагулянтов, значительной гемодилюции, гипокоагуляционной фазе диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови и др.

Понижение (менее 4-6 мин) клинически малоинформативно; можно предположить гиперактивацию плазменных факторов или нарушение реологических свойств крови, но чаще укорочение время свертывания крови связано с нарушением техники взятия крови (травматичностью процедуры) или тромбоцитозом. Для дифференцировки требуется проведение скрининговых (оценочных) коагулологических тестов.

Время свертывания крови активированное
Действие каолина при выполнении теста считается аналогичным появлению в кровотоке контактной поверхности - коллагена субэндотелия, искусственных клапанов сердца, протезированных сосудов, магистралей аппаратов для экстра-корпоральных методов лечения и т. д. При этом происходят последовательная каскадная активация плазменных белковых факторов внутреннего пути гемостаза, образование тромбина и формирование фибринового сгустка.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Основная задача при взятии крови - минимальное травмирование тканей, чтобы не спровоцировать высвобождение тканевого фактора.

При взятии капил¬лярной крови желательно пользоваться стандартным ланцетом с круглой иглой, минимально травмирующей ткани при проколе. Во избежание искажения результатов нельзя выдавливать кровь из пальца.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест выполняют на специальных коагулометрах для цельной крови с одноразовыми картриджами, содержащими стандартное количество активатора контактной фазы - каолина. В некоторых картриджах, кроме каолина, содержится инактиватор гепарина, исключающий его влияние на результаты теста. Кровь собирают в картридж прибора с помощью специальной пипетки или капилляра и быстро перемешивают; дальнейшая процедура определения идет автоматически. Момент образования сгустка определяется по изменению сопротивления между электродами, контактирующими с кровью, и образующимся сгустком (электро-метрическое определение) или по затруднению вращения пластикового флажка в кювете (механический коагулометр).

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
В большинстве приборов результат колеблется в пределах 80-120 с, зависит от серии картриджей, условий их хранения и использования, количества и свойств каолина, интенсивности и полноты перемешивания крови с каолином, типа регистратора, температуры. В связи со стандартизацией контактной активации свертывания разброс результатов существенно меньший по сравнению с тестом времени свертывания крови.

Для теста нет калибровочных и контрольных материалов (контрольной цельной крови). О качестве анализа можно приближенно судить по результатам исследования венозной или капиллярной крови нескольких здоровых людей.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Увеличение тестом времени свертывания крови свидетельствует о гипокоагуляционных сдвигах - дефиците или инактивации плазменных факторов, циркуляции антикоагулянтов, выраженной гемодилюции, гипокоагуляционной фазе диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, а также возможно при тромбоцитопении. Уменьшение тестом времени свертывания крови активированного может наблюдаться при гиперактивации плазменных факторов, но оно не является основанием для окончательного вывода о состоянии гиперкоагуляции и принятия терапевтических мер (необходимы дополнительные исследования).

В основном определение времени свертывания крови активированного проводят для контроля и регулирования уровня гепаринизации пациента во время работы искусственных органов (аппаратов искусственного кровообращения, искусственной почки, печени, гемосорбции), расчета нейтрализующей дозы протамина сульфата и оценки полноты нейтрализации гепарина. Достоинством метода является возможность исследования непосредственно у постели больного или в операционной (poin of саге - диагностика по месту лечения), а также относительная быстрота выявления больных, резистентных к гепарину, когда для достижения оптимального эффекта приходится вводить повышенные дозы препарата.

Каолиновое время
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы при 37 °С после стандартной активации контактной фазы каолином (цеолитом) и рекальцификации (восстановления физиологической концентрации ионов Са2+, ранее связанных цитратом при взятии крови). Матрицей для сборки ферментных комплексов коагуляции служат оставшиеся в плазме после центрифугирования тромбоциты паци-ента и фрагменты фосфолипидных мембран, но их недостаточно для полноценного протекания коагуляционных реакций. Именно поэтому тест, помимо коагуляционных факторов, чувствителен к количеству фосфолипидных образований в плазме и их свойствам, а также к присутствию антифосфолипидных антител.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза; накладывают жгут не более чем на 1 мин, используют одноразовые острые иглы достаточного диаметра, расслабляют жгут после появления крови из иглы и выпускают первые капли на ватный тампон. Кровь берут в пробирку с 3,2% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 и немедленно перемешивают. Более предпочтительны вакуумные системы для взятия крови, содержащие цитрат; их содержимое перемешивают четырехкратным переворачиванием. Пробирки с цитратной кровью центрифугируют при 1500-2000 g в течение 15 мин и осторожно отбирают супернатант - бедную тромбоцитами плазму. Хранить бедную тромбоцитами плазму до исследования лучше в пластиковых пробирках и непосредственно перед анализом перемешать.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
К бедной тромбоцитами плазме добавляют суспензию каолина, прогревают при 37 °С, вносят раствор кальция хлорида и запускают секундомер (или начинают измерение на коагулометре). Определяют время образования фибринового сгустка на коагулометре (предпочтительно) или периодически наклоняя пробирку в водяной бане. Рекомендуют усреднять показатели двух определений одной и той же плазмы.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Результат колеблется в пределах 65-90 с.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
На результаты теста сильно влияют условия центрифугирования крови (от них зависит остаточное количество тромбоцитов), а также количество и свойства добавляемого каолина.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Значения каолинового времени свыше 90 с могут свидетельствовать о гипокоагуляции - дефиците плазменных факторов (XII, XI, IX, VIII, X, V, II, фибриногена), гипокоагуляционной фазе диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, выраженной гемодилюции, циркуляции антикоагулянтов (гепарина и др.) или наличии ингибиторов плазменных факторов и антифосфолипидных антител. Каолиновое время менее 65 с часто бывает связано с нарушением условий центрифугирования или взмучиванием осадка при отборе супернатанта. Кроме того, аналогичные сдвиги возможны при гиперактивации плазменных факторов (в гиперкоагуляционной фазе диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови крови), недостатке естественных антикоагулянтов и др.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест каолинового времени, выполняемый на бедной тромбоцитами плазме, сохранил свое значение лишь при определении волчаночного антикоагулянта; в других случаях желательно выполнение более информативного теста активированного частичного тромбопластинового времени, дающего меньший разброс результатов.

Активированное частичное (парциальное) тромбопластиновое время
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы при физиологической температуре (37 °С), в условиях стандартной активации контактной фазы, в присутствии фосфолипидов и при добавлении ионов Са2. Заменителем тромбоцитарной фосфолипидной матрицы для сборки коагуляционных ферментных комплексов служат фосфолипиды мозга, эритроцитов или сои, заменителем активационной контактной поверхности - каолин или эллаговая
кислота. Благодаря отсутствию тромбоцитов в плазме и добавлению их заменителя - парциального тромбопластина - на результаты теста практически не влияют тромбоцитарные факторы. Возможно определение активированного частичного тромбопластинового времени на портативных коагулометрах со специализированными картриджами. Иногда тест обозначают как активированное парциальное тромбопластиновое время активированного частичного тромбопластинового времени, что является аналогом активированного частичного тромбопластинового времени.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза (с добавлением цитрата) и получения бедной тромбоцитами плазмы. Параметры активированного частичного тромбопластинового времени стабильны до 4 ч при комнатной температуре; при лечении гепарином исследование необходимо провести в течение 1 ч после взятия материала. Возможно хранение замороженной бедной тромбоцитами плазмы до 10-20 дней, но допустимо лишь однократное размораживание.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 20-45 с. Результаты теста активированного частичного тромбопластинового времени зависят от точности соотношения кровь/цитрат, вида и свойств фосфолипидного компонента и каолина (или эллаговой кислоты), температуры, а также от способа регистрации результатов, типа и чувствительности прибора, вида и активности реагентов, а также от типа оборудования. Каждой лаборатории рекомендуют определить свои, локальные значения нормы.

Для снижения влияния интерферирующих факторов возможна оценка результата в виде индекса активированного частичного тромбопластинового времени, диапазон нормальных значений которого составляет 0,8-1,2:

Индекс АЧТВ = АЧТВ пациента / АЧТВ контрольной нормальной плазмы.

Возможные варианты контрольной плазмы для расчета индекса активированного частичного тромбопластинового времени:
Смесь плазм не менее чем от 10 здоровых людей, полученных в тех же условиях, что и плазма пациента (это проблематично для небольших лабораторий). Кроме того, обычно не бывает уверенности в том, что эти люди здоровы.
Лиофилизированная референтная нормальная пулированная плазма (РНП-плазма), которую следует разводить за 30 мин до исследования. Лучше, чтобы плазма была заранее протестирована на данном виде прибора и рекомендована производителем оборудования в качестве референтной.
Оптимальный вариант - перекалибровка конкретного типа прибора для определенных видов реагентов и плазм, используемых в лаборатории (так поступают крупные производители лабораторного оборудования). В этом случае для расчетов индекса активированного частичного тромбопластинового времени можно использовать результат измерения аттестованной контрольной плазмы нормального уровня.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Стандартный контрольный материал ВОЗ для теста активированного частичного тромбопластинового времени отсутствует, поскольку при определении используют различные реагенты и приборы разной чувствительности. В коагуляционных исследованиях желательно соблюдать рекомендации производителя оборудования для выбора контрольных материалов. Для контроля качества чаще используют свежеразведенную референтную нормальную пулированную плазму, срок годности - 2-4 ч после разведения лиофилизированного препарата) с аттестованным значением активированного частичного тромбопластинового времени. Смешанная бедная тромбоцитами плазма от нескольких здоровых людей (годна в течение 4-6 ч с момента получения) может быть использована для оценки сходимости и воспроизводимости или как вторичный стандарт. Разброс результатов при исследовании одного образца плазмы и использовании реактивов одной серии не дол¬жен превышать 10%. 

Нельзя исследовать плазму, имеющую сгустки или следы гемолиза, поскольку из-за активации гемостаза активированного частичного тромбопластинового времени такой пробы может быть уменьшено. При наличии в исследуемой плазме гепарина активированного частичного тромбопластинового времени может значительно удлиняться - до 300 с и более, вплоть до полного несвертывания. Антикоагулянт может попасть в пробу при получении крови из катетера (что крайне нежелательно) или при системном использовании гепарина. В том случае, когда избежать попадания гепарина в пробу невозможно, для исключения эффекта антикоагулянта используют АЧТВ-реагент с инактиватором гепарина либо плазму предварительно обрабатывают сорбентом гепарина и центрифугируют, сливая ее с осадка.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Удлинение активированного частичного тромбопластинового времени может свидетельствовать:
о врожденном или приобретенном снижении количества/активности факторов внутреннего пути гемостаза (XII, XI, IX, VIII, X, V, II, фибриногена), реже - фактора фон Виллебранда. Снижение факторов IX, X и II возможно, в частности, при лечении непрямыми антикоагулянтами;
об избытке в пробе цитрата - абсолютном (слишком большое количество добавленного цитрата) или относительном (неполное заполнение кровью пробирки со стандартным количеством цитрата);
о наличии в пробе гепарина (при введении пациенту или попадании из катетера) или гирудина;
о наличии в пробе некоторых инфузионных препаратов (декстранов);
о наличии в пробе продуктов деградации фибрина/фибриногена, патологических ингибиторов плазменных факторов или антикоагулянтов волчаночного типа.

Уменьшение активированного частичного тромбопластинового времени клинического значения не имеет, поскольку часто бывает связано с погрешностями взятия и обработки крови. Диагностика гиперкоагуляционных состояний должна основываться на определении маркеров активации гемостаза и оценке конкретной клинической ситуации.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест активированного частичного тромбопластинового времени - один из базовых методов исследования коагуляционных свойств плазмы, выявляющий сдвиги внутреннего пути активации свертывания (клиническое значение имеет удлинение активированного частичного тромбопластинового времени). Определение активированного частичного тромбопластинового времени проводят для первичного выявления гипокоагуляционных сдвигов, диагностики гемофилии и мониторинга состояния больных с нарушениями свертывания крови, при диссеминированном внутрисосудистом свертывании, для контроля гепаринотерапии, выявления патологических ингибиторов. При диагностике антифосфолипидного синдрома для определения волчаночного антикоагулянта используют так называемый люпус-чувствительный АЧТВ-реагент со сниженным содержанием фосфолипидов.

Коррекционные пробы по тесту активированного частичного тромбопластинового времени
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют активированное частичное тромбопластиновое время смеси исследуемой плазмы с нормальной донорской плазмой либо плазмой, дефицитной по отдельным факторам свертывания. Пробы позволяют разграничить причину удлинения активированного частичного тромбопластинового времени - дефицит/дисфункцию факторов свертывания (с определением конкретного недостающего фактора) или наличие ингибиторов свертывания.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Перед выполнением проб необходимо определение активированного частичного тромбопластинового времени исследуемой плазмы; коррекцию проводят лишь при его удлинении. Отдельную порцию тестируемой плазмы смешивают в соотношении по объему 1:1 со свежей нормальной пулированной донорской плазмой или свежеразведенной РНП-плазмой (либо плазмой, дефицитной по отдельным факторам) и повторяют определение активированного частичного тромбопластинового времени.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
На результаты проб может влиять присутствие в тестируемых образцах прямых антикоагулянтов (гепарина и гирудина).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
При наличии в исследуемой пробе ингибиторов свертывания (волчаночного антикоагулянта, ингибиторов факторов VIII и IX) добавка нормальной плазмы не приводит к нормализации активированного частичного тромбопластинового времени. При дефиците факторов в исследуемой плазме недостающие вещества вносят в составе добавки нормальной плазмы, после чего удлиненное активированное частичное тромбопластиновое время становится нормальным. Добавляя субстратную плазму, дефицитную по отдельным факторам, можно определить конкретный недостающий фактор; при добавке плазмы, дефицитной именно по этому фактору, активированное частичное тромбопластиновое время не приходит к норме, в то время как дефицитные плазмы по другим факторам вызывают нормализацию параметра.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
С помощью коррекционных проб по тесту активированного частичного тромбопластинового времени выявляют дефицит факторов внутреннего пути гемостаза и/или наличие их ингибиторов (диагностика врожденной и ингибиторной гемофилии, антифосфолипидного синдрома).

Протромбиновое время
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Исследование протромбинового времени представляет важнейший скрининговый тест для оценки системы свертывания крови. Определяют время образования фибринового сгустка в бедной тромбоцитами цитратной плазме при активации внешнего пути гемостаза тканевым тромбопластином, содержащим тканевый фактор и фосфолипиды, в присутствии ионов Са2+ при 37 °С. Источником тромбопластина могут быть эритроциты, ткани мозга или другие ткани; может быть использован и рекомбинантный тромбопластин. Возможно определение протромбинового времени цельной крови на портативных коагулометрах со специальными картриджами.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза. Оптимальным является исследование венозной крови. Капиллярная кровь менее пригодна для определения протромбинового времени, поскольку содержит непредсказуемое количество тканевого фактора, попадающего в нее при проколе пальца, что создает определенные проблемы (в частности, в педиатрии). Капиллярную кровь имеет смысл исследовать при наличии специальных портативных коагулометров, в которых время образования сгустка выражается в пересчете на эквивалент венозной крови и используются картриджи с реагентами, сводящими к минимуму влияние «собственного» тканевого фактора. Кровь из пальца берут непосредственно перед анализом, избегая давления на мягкие ткани; первую каплю удаляют ватным тампоном. Взятую кровь смешивают с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, капилляр для взятия предварительно промывают тем же раствором цитрата.

Результаты теста протромбинового времени остаются стабильными до 24-48 ч при хранении венозной крови с цитратом при комнатной температуре в закрытых первичных вакуумных пробирках. При работе с открытыми пробирками требуется отделить плазму от клеток в течение 60 мин и провести определение протромбинового времени в течение 2-4 ч после взятия крови. Полученную плазму до исследования хранят при комнатной температуре; охлаждение до 4 °С более чем на 24 ч может привести к Холодовой активации фактора VII и уменьшению протромбинового времени.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследуемую плазму прогревают до 37 °С, вносят тромбопластиновый реагент с кальция хлоридом и определяют время образования фибринового сгустка (на коагулометре или вручную). При определении протромбинового времени капиллярной крови используют тот же принцип, но применяют реагенты с иной концентрацией действующих веществ, а измерение проводят вручную или на коагулометре с механическим принципом регистрации (желательно в параллельных пробах с вычислением среднего результата).

МЕТОДЫ ОЦЕНКИ РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА ПРОТРОМБИНОВОГО ВРЕМЕНИ Протромбиновая активность плазмы по Квику
Тест основан на расчетах по калибровочному графику, отражающему зависимость активности протромбинового комплекса (т. е. значения протромбинового времени) от степени разведения нормальной плазмы, выраженной в процентах. Для построения калибровочного графика определяют протромбиновое время неразведенной свежей нормальной пулированной плазмы (100%) и ее 50, 25 и 12,5% разведений. Некоторые исследователи считают нецелесообразным разведение 12,5% из-за снижения содержания фибриногена. Результаты откладывают на координатной сетке и соединяют линией.

При тестировании плазмы пациента измеряют значение протромбинового времени и по калибровочному графику определяют процент протромбина по Квику, отражающий активность факторов протромбинового комплекса в процентах к плазме здоровых людей. Современные коагулометры автоматически рассчитывают этот показатель исходя из результатов определения протромбинового времени в плазме пациента и разведениях контрольной плазмы.

Протромбиновая активность плазмы по Оврену
Кроме теста Квика, при оценке действия непрямых антикоагулянтов возможно исследование плазмы по Оврену. В нем используют реагенты с добавлением адсорбированной бычьей плазмы, содержащей фактор V и фибриноген, что позволяет исключить влияние этих двух компонентов на результаты теста и исследовать активность других факторов протромбинового комплекса (VII, X и II). При этом образцы исследуемых плазм остаются стабильными более длительное время, так как метод оказывается не зависимым от активности термолабильного фактора V.

Расчетные показатели на основе протромбинового времени
Для снижения влияния интерферирующих факторов рекомендуют одновременно определять протромбиновое время исследуемой пробы и референтной нормальной пулированной плазмы, а оценку результата проводить в виде отношений протромбинового времени. Современные коагулометры и анализаторы гемостаза автоматически рассчитывают показатели исходя из результатов определения протромбинового времени в пробе пациента и нормальной плазме.
Протромбиновое отношение: ПО = ПВ пациента / ПВ нормальной плазмы.
Показатель протромбинового отношения имеет прямую логическую связь с изменениями протромбинового времени плазмы пациента (удлинение протромбинового времени влечет за собой увеличение протромбинового отношения). Вместе с тем на результаты определения протромбинового отношения влияет чувствительность конкретного используемого тромбопластина к недостатку факторов внешнего пути (VII, X, V и II), что может привести к несопоставимости данных, полученных с разными партиями реагента.
Прием антикоагулянтов непрямого действия приводит к удлинению протромбинового времени, однако измеренная степень его удлинения существенно колеблется в зависимости от используемого тромбопластинового реагента. В связи с этим Комитет по стандартизации в гематологии ВОЗ в 1983 г. принял стандартизированный показатель - международное нормализованное отношение, который рассчитывают при контроле лечения непрямыми антикоагулянтами (когда недопустимы колебания показателей протромбинового теста в зависимости от применяемых реагентов). Международное номализованное отношение вычисляют исходя из протромбинового отношения и международного индекса чувствительности используемого тромбопластина к нехватке факторов протромбинового комплекса: МНО = ПОмич.
Международный индекс чувствительности для каждой серии реагента обозначается на его упаковке и обычно составляет от 1,0 до 1,6 (более низкое значение предпочтительнее). При использовании тромбопластина, не аттестованного по международному индексу чувствительности, расчет международного нормализованного отношения невозможен; в этом случае определяют протромбиновую активность по Квику.
При определении междунарожного нормализованного отношения в пробе капиллярной крови вследствие влияния форменных элементов крови результат получается менее надежным по сравнению с анализом плазмы, поэтому без использования специальных портативных коагулометров выполнять это исследование не рекомендуют.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Протромбированное время=10-20 с (зависит от типа реагента и условий определения). Доля протромбина по Квику составляет 60-130% (зависит от препарата тромбопластина); некоторые производители указывают только нижнюю границу нормы (например, более 70%), подчеркивая, что уменьшение протромбинового времени и повышение процента протромбина клинического значения не имеют. 

Протромбиновое отношение=0,85~1,2. Референтные значения для междурародного нормализованного отношения указывать некорректно, так как этот показатель должен исследоваться у больных, принимающих антикоагулянты непрямого действия; терапевтический интервал международного нормализованного отношения выбирают в зависимости от показаний к назначению препаратов.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Результаты теста протромбинового времени зависят от объема взятой крови по отношению к количеству цитрата в пробирке, активности препарата тромбопластина и его чувствительности к недостатку факторов VII, X, V и II, а также от температуры. При наличии гепарина в исследуемом образце протромбиновое время может значительно удлиняться - до 40 с и более; для исключения такого влияния плазму предварительно обрабатывают сорбентом гепарина и центрифугируют.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
В тесте Квика калибровочный график строят для каждой новой серии исследований (на одни сутки) и каждой новой серии тромбопластинового реагента. Для обеспечения корректности результатов во всех случаях используют только свежую пулированную плазму от здоровых доноров или свежеразведенную нормальную плазму, для контроля качества - РНП-плазму. Стандартный контрольный материал ВОЗ для теста протромбинового времени отсутствует, поскольку используют различные реагенты и приборы разной чувствительности, однако производители, как правило, предлагают контрольные плазмы для конкретных условий (реагенты/оборудование). Для оценки воспроизводимости и сходимости может быть использована свежая смешанная плазма от нескольких здоровых доноров (не менее 10) или свежеразведенная лиофилизированная нормальная пулированная плазма (РНП-плазма), срок их годности - 2-4 ч с момента получения или 2 ч после разведения лиофилизированного препарата соответственно. Для повышения точности рекомендуют проводить определение на коагулометре; при исследовании параллельных проб разброс результатов протромбинового времени не должен превышать 1 с.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Увеличение протромбинового времени или снижение процента протромбина по Квику может быть связано с врожденным (редко) или приобретенным снижением активности либо дефицитом факторов внешнего пути активации свертывания или (реже) наличием их ингибиторов. Это возможно при заболеваниях печени, коагулопатиях потребления и потерях факторов, дефиците витамина К, приеме некоторых лекарственных препаратов (особенно антагонистов витамина К). При достаточном содержании факторов удлинение протромбинового времени возможно при снижении содержания фибриногена менее 1,5-1,0 г/л, а также под действием прямых антикоагулянтов, но в последнем случае тест протромбинового времени менее чувствителен по сравнению с активированным частичным тромбопластиновым временем.

Уменьшение протромбинового времени или возрастание процента протромбина по Квику не имеют клинического значения, хотя и способны отражать гиперактивность факторов внешнего пути (в том числе при нарушениях процедуры взятия крови).

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест протромбинового времени - один из базовых методов исследования коагуляционных свойств плазмы и цельной крови. Определение протромбинового времени используют для контроля лечения антикоагулянтами непрямого действия, выявления изменений количества и активности факторов протромбинового комплекса (VII, X, V и II) и оценки белоксинтезирующей функции печени. Значительное возрастание протромбинового времени часто связано с риском кровотечений. 

ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ СКРИНИНГОВЫХ КОАГУЛЯЦИОННЫХ ТЕСТОВ
Изолированное удлинение активированного частичного тромбопластинового времени:
в согетании с кровотогивостью - недостаточность/дефект факторов VIII, IX, XI;
при отсутствии кровотогивости - недостаточность/дефект факторов XII, XI, высокомолекулярного кининогена, присутствие волчаночного антикоагулянта.

Изолированное удлинение протромбинового времени;
недостаточность/дефект фактора VII (редкое состояние).

Сочетанное удлинение удлинение активированного частичного тромбопластинового времени и протромбинового времени;
действие лекарств - антикоагулянтов, варфарина, массивных трансфузий;
патологигеские состояния - активированное частичное тромбопластиновое время крови, патология печени, дефицит витамина К;
редко встрегаемые состояния - дисфибриногенемии, недостаточность/ дефект факторов X, V, II.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют время образования фибринового сгустка при добавлении стан-дартного раствора тромбина к исследуемой цитратной плазме при 37 °С. При этом время реакции зависит в основном от концентрации и свойств фибриногена, а также наличия и действия антитромбинов.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
К исследуемой бедной тромбоцитами плазме при 37 °С добавляют раствор тромбина и определяют время образования фибринового сгустка (автоматически или вручную). Параллельно тестируют нормальную плазму.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 14-17 с (в зависимости от активности тромбина).

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
При наличии гепарина в исследуемой плазме тромбиновое время может увеличиваться до 120 с и более. Если необходимо исключить эффект антикоагулянта, плазму предварительно обрабатывают сорбентом гепарина, центрифугируют и исследуют супернатант.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества используют РНП-плазму; коэффициент вариации значений тромбинового времени обычно не превышает 5%. Каждой лаборатории рекомендуют определить свои референтные значения (с учетом конкретных условий).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Удлинение тромбинового времени может быть вызвано присутствием в крови прямых антикоагулянтов, парапротеинов, гипофибриногенемией, дисфибриногенемией (качественный дефект фибриногена) или накоплением в крови продуктов деградации фибрина и фибриногена, которые обладают антитромбиновой активностью и препятствуют полимеризации мономеров фибрина.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тромбиновое время - один из базовых методов исследования коагуляционных параметров плазмы. Тест проводят для выявления нарушений на этапе превращения фибриногена в фибрин, зависящем в основном от количества фибриногена и ингибиторов фибринообразования - гепарина др. Значительное удлинение тромбинового времени свидетельствует о риске развития кровотечений. Рептилазное время (батроксобиновое, анцистроновое)

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют время образования фибринового сгустка в цитратной плазме под действием тромбиноподобного ферментного препарата змеиного яда - батроксобина или анцистрона, напрямую отщепляющего фибринопептид А от фибриногена и образующего активные фибрин-мономеры, которые в ходе полимеризации формируют сгусток. Тест нечувствителен к гепарину и его комплексу с антитромбином.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
К плазме добавляют один из указанных препаратов змеиного яда, содержащих ферменты прямого фибринообразования. Определение проводят аналогично тесту тромбинового времени; сравнивают время свертывания исследуемой и нормальной плазмы.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рептилазное время уменьшается при гиперфибриногенемии и удлиняется при снижении фибриногена и некоторых дисфибриногенемиях, а также при гиперфибринолизе и наличии в кровотоке большого количества продуктов деградации фибрина, затрудняющих полимеризацию фибрин-мономеров. Тест можно проводить в присутствии гепарина. На результаты не влияют антитела к факторам свертывания и волчаночному антикоагулянту.

Фибриноген (концентрация)
Фибриноген - основа для образования фибриновых сгустков - синтезируется в печени и постоянно присутствует в плазме. От его молекул под действием тромбина отщепляются фибринопептиды и образуются фибрин-мономеры, которые затем самопроизвольно полимеризуются и перекрестно «сшиваются».

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Хронометрический метод предполагает определение времени образования фибринового сгустка при добавлении избытка высокоактивного тромбина к разведенной в 10 раз плазме (для снижения влияния антитромбиновых компонентов) при 37 °С. В этих условиях время реакции зависит в основном от концентрации фибриногена, которая определяется по калибровочному графику. Реже применяемый турбидиметрический кинетический метод сводится к двух-точечному определению скорости нарастания мутности среды при образовании фибрина после добавления к разведенной плазме тромбопластин-кальциевого реагента или препарата змеиного яда.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза и получения бедной тромбоцитами цитратной плазмы. При взятии капиллярной крови ее сразу перемешивают в пропорции 1:1 с антикоагулянтом. Материал для исследования стабилен в течение 8 ч при хранении в закрытой пластиковой или силиконированной стеклянной пробирке. Во избежание возможного искажения результатов нежелательно исследовать плазму, имеющую сгустки, следы гемолиза, а также полученную более чем за 8 ч до анализа.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Хронометрический метод требует предварительного построения калибровочного графика путем разведения стандартной нормальной плазмы буферным раствором для получения калибровочных проб, эквивалентных плазме с содержанием фибриногена от 1 до 6 г/л. Исследование проводят на коагулометре при 37 °С; к калибровочным пробам и разведенной буферным раствором в 10 раз исследуемой плазме добавляют раствор тромбина и определяют время до образования сгустка. Концентрацию фибриногена в исследуемой плазме находят по калибровочному графику. Если она превышает 5-6 г/л, для получения корректных данных рекомендуют повторить определение, разведя плазму буферным раствором не в 10, а в 20 раз, полученный результат умножить на 2.

Турбидиметрический метод схож с тестом рептилазного времени, но исследование проводят не на коагулометре, а на фотометрическом анализаторе, позволяющем определить кинетику нарастания мутности среды. Скорость помутнения при образовании фибрина зависит от исходной концентрации фибриногена в плазме, которая определяется по результатам исследования калибровочных проб (требуется многоточечная калибровка). Турбидиметрический метод используют в некоторых автоматических анализаторах гемостаза, в этом же тесте можно одновременно определить протромбиновое время.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
У взрослых - 1,8-4,0 г/л, у новорожденных - 1,2-3,0 г/л.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Хронометрический метод может давать некорректные результаты при дисфибриногенемии, а также при попадании в кровь большого количества гепарина (например, из венозного катетера). При исследовании капиллярной крови результат зависит от действия множества дополнительных интерферирующих факторов (форменных элементов крови, разного гематокрита), что снижает точность метода.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества определения фибриногена используют контрольную РНП-плазму, для калибровки - разведения стандартной плазмы либо стандартные растворы фибриногена. Разброс результатов при работе с одной и той же пробой плазмы не должен превышать 5%. Показания разных методов на одной и той же пробе плазмы могут существенно отличаться друг от друга, особенно при гипо- или гиперфибриногенемии. Именно поэтому в лаборатории рекомендуют придерживаться какого-либо одного метода, тщательно отладив его и регулярно проводя калибровку и контроль качества.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Фибриноген синтезируется в печени и относится к группе белков острой фазы. Повышение его концентрации в плазме возможно при любой острофазовой реакции (воспалении, инфекциях, ожогах, травмах, в послеоперационном периоде, остром инфаркте миокарда), а также при болезнях почек, системных заболеваниях соединительной ткани, злокачественных новообразованиях и др. У здоровых женщин уровень фибриногена возрастает при беременности, введении эстрогенных препаратов и во время менструации.

Основные причины снижения содержания фибриногена - гиперпотребление при образовании большого количества микросгустков, распад в результате действия фибринолитических препаратов (стрептокиназы и т. п.) или нарушение синтеза при тяжелой патологии печени (циррозе, острой дистрофии), а также значительная гемодилюция. Необходимо учитывать, что тяжелые гнойно-воспалительные процессы, приводящие к развитию синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, могут способствовать повышению уровня фибриногена как острофазного белка и тем самым маскировать его усиленное потребление.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Определение концентрации фибриногена - базовый метод исследования коагуляционных свойств плазмы, входящий во все скрининговые схемы. Исследование проводят для выявления причины и оценки степени риска кровотечений и тромбозов. При увеличении концентрации фибриногена резко повышается вязкость крови, но ее свертывание in vitro не ускоряется. Длительно повышенная концентрация фибриногена опасна, поскольку возрастает риск тромбозов и ишемии органов и тканей. При уменьшении количества фибриногена ниже 1 г/л возможны кровотечения.

Фактор VIII (активность)
Плазменный фактор VIII (антигемофильный глобулин) синтезируется в печени, селезенке, клетках эндотелия, лейкоцитах, почках. В крови фактор VIII находится в комплексе с фактором фон Виллебранда, который стабилизирует фактор VIII и существенно увеличивает период его циркуляции (до 12-24 ч). При воздействии минимального количества тромбина фактор VIII высвобождается из комплекса и проявляет свой прокоагулянтный эффект.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза и получения цитратной плазмы. В связи с малой стабильностью фактора VIII плазма должна быть получена в кратчайшие сроки. В свежезамороженной плазме при быстром и правильном оттаивании активность фактора VIII мало отличается от свежей плазмы.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В клоттинговом тесте определяют активированное частичное тромбопластиновое время смеси субстратной плазмы, дефицитной по фактору VIII (
В хромогенном методе инкубация разведенной исследуемой плазмы с добавлением фактора Ха, фосфолипидов, Са2+ и избытка фактора X приводит к активации последнего, чему способствует фактор VIII. Образующийся фактор Ха гидролизует специфический хромогенный субстрат с освобождением окрашенного я-нитроанилина. Образующийся в смеси тромбин, также способный гидролизовать хромогенный субстрат, блокируется добавляемым синтетическим ингибитором. Скорость нарастания оптической плотности при А=405 нм пропорциональна активности фактора VIII в исследуемой плазме. Смешивают препараты факторов Ха и X, фосфолипидов, добавляют разведенную буферным раствором исследуемую плазму, хромогенный пептидный субстрат и при 37 °С определяют скорость нарастания оптической плотности при V=405 нм кинетическим методом. Определение проводят на фотометре, биохимическом анализаторе или анализаторе гемостаза с фотометрическим каналом, результат выражают в процентах стандартной нормальной плазмы. Каждый образец исследуют дважды, вычисляют среднеарифметическое значение. Диапазон линейности метода - от 0 до 130%.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Те же, что в тесте активированного частичного тромбопластинового времени. Активность фактора VIII нельзя определять при наличии в пробе гепарина или на фоне его действия.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества используют контрольную плазму, активность фактора VIII в которой указывается в аттестате и соответствует нормальному (80-120%; 0,8-1,2 МЕ/мл) и патологическому уровню.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора VIII наиболее часто связано с нарушением его синтеза (при гемофилии А) или появлением ингибиторных антител, а также с ускоренным распадом («незащищенностью» фактора VIII при болезни фон Виллебранда); реже - с гиперпотреблением. При уровне фактора VIII от 6 до 25% констатируют недостаточность легкой степени, от 1 до 5% - средней, менее 1% - тяжелой степени. Существенное снижение уровня фактора VIII сопровождается кровотечением после травм и кровоизлияниями в суставы, мышцы и другие органы и ткани. При снижении активности фактора VIII в плазме менее 25% увеличивается риск развития послеоперационных кровотечений. Активность фактора VIII возрастает при острофазовых реакциях (воспалении, травмах и т. д.), беременности и лечении эстрогенными препаратами, после спленэктомии, а также может увеличиваться при сахарном диабете и опухолевом процессе. Активность фактора VIII, превышающую 175%, расценивают как тромбофилическое состояние. 

Фактор IX (активность/количество)
Плазменный фактор IX, или фактор Кристмаса, синтезируется в печени (синтез зависит от витамина К). При каскадной активации внутреннего пути гемостаза активированный фактор IX в составе теназного ферментного комплекса (на фосфолипидной матрице) способствует переходу фактора X в активную форму, образованию протромбиназы, тромбина и фибринового сгустка. В процессе свертывания крови фактор IX не потребляется и остается в сыворотке.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Принцип определения клоттинговым методом такой же, как при исследовании активности фактора VIII, но в качестве субстрата используют плазму, дефицитную по фактору IX. Иммуноферментное определение основано на связывании определяемого фактора IX с фиксированными на поверхности лунки планшета моноклональными антителами к данному фактору и их конъюгатом с пероксидазой; калибровку осуществляют по разведениям стандартной калибровочной плазмы, входящей в набор.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 50-150% (0,5-1,5 МЕ/мл).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора IX может быть связано с нарушением его синтеза (гемофилией В, тяжелыми гепатитами и циррозами печени, лечением непрямыми антикоагулянтами), а также с появлением ингибиторных антител. При уровне фактора от 25 до 50% констатируют скрытую недостаточность, от 6 до 24% - недостаточность легкой степени, от 1 до 5% - средней степени, менее 1% - тяжелую форму недостаточности. Выраженная недостаточность фактора IX сопровождается геморрагическими проявлениями, минимальный уровень активности в крови для предупреждения послеоперационных кровотечений составляет 20-25% нормы. Количество/активность фактора IX могут возрастать при лечении эстрогенными препаратами и при почечной недостаточности. Если активность фактора IX превышает 200%, развивается тромбофилическое состояние.

Фактор X(активность/количество)
Витамин К-зависимый фактор X (фактор Стюарта-Прауэра) синтезируется в печени и занимает одно из центральных мест в системе плазменного гемостаза. При каскадной активации как внутреннего, так и внешнего пути гемостаза фактор X превращается в активную протеазу - фактор Ха, который в присутствии других компонентов протромбиназного комплекса (фактора Va, фосфолипидов и Са2+) превращает протромбин в тромбин и способствует образованию фибринового сгустка.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Изолированная недостаточность фактора X в исследуемой плазме может быть обнаружена по удлинению активированного частичного тромбопластинового времени и особенно протромбиновое время, которые приходят к норме в микс-тесте с нормальной донорской плазмой, но остаются удлиненными при добавке дефицитной по ф. X плазмы.

Количественное определение фактора X в клоттинговом тесте проводят аналогично исследованию активности фактора VIII, но вместо активированного частичного тромбопластинового времени применяют тест протромбиновое время и используют плазму, дефицитную по данному фактору. Антиген к фактору X может быть определен иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител. Методом определяют количество, но он не дает представления об активности анализа. При применении хромогенного метода фактор X в разведенной исследуемой плазме переводится в активное состояние специфическими протеазами из яда гадюки Рассела (Russel Viper Venom - RVV) в присутствии Са2+. Образующийся фактор Ха гидролизует специфический хромогенный субстрат с высвобождением окрашенного нитроанилина; скорость нарастания оптической плотности при > или =405 нм пропорциональна концентрации фактора X. Определение проводят на фотометре, биохимическом анализаторе или анализа¬торе гемостаза с фотометрическим каналом; результаты выражаются в процентах активности фактора в стандартной плазме (линейность метода - от 10 до 130%).

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 50-150%.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Исследование необходимо провести не позднее 2 ч после взятия крови. Липемичные, иктеричные и гемолизированные образцы исследовать не рекомендуют; в противном случае необходим бланк-контроль с плазмой пациента. Для контроля качества используют нормальную и патологическую плазмы с аттестованным уровнем фактора X. Оценку метода можно проводить с использованием РНП-плазмы или свежей (свежеразмороженной) пулированной плазмы от нескольких здоровых людей.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора X чаще бывает связано с нарушением его синтеза в печени (дефицитом витамина К, действием непрямых антикоагулянтов, тяжелой патологией печени) или исчезновением из кровеносного русла при амилоидозе (изолированной недостаточностью фактора X). Концентрация фактора X может также снижаться при гепаринотерапии из-за связывания и инактивации комплексом «АТ-гепарин». Врожденный дефицит фактора наблюдается редко.

Исследование проводят при сочетанном удлинении активированного частичного тромбопластинового времени и протромбинового времени для выявления причины гипокоагуляции. Минимальный гемостатический уровень активности фактора X в крови - 5-10%, для послеоперационной остановки кровотечения - 10-20% нормы. Более выраженное уменьшение сопровождается кровоточивостью.

Поскольку активность синтезируемого в печени фактора X снижается под влиянием антикоагулянтов непрямого действия, наряду с активностью протромбина ее можно применять при мониторинге терапии варфарином.

Фактор VII (активность/количество)
Плазменный витамин К-зависимый фактор VII (проконвертин) синтезируется в печени и циркулирует в крови. При повреждении тканей и попадании в кровоток тканевого фактора образуется активная форма фактора Vila, которая в виде комплекса «ТФ-фактор Vila» активирует факторы IX и X, что, в свою очередь, приводит к образованию тромбина и формированию фибринового сгустка.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Клоттинговый метод основан на коррекции удлиненного протромбинового времени исследуемой плазмы добавкой нормальной пулированной плазмы, но отсутствии коррекции в микс-тесте плазмы больного и субстратной плазмы, дефицитной по фактору VII. Имеется информация о хромогенном методе определения фактора VII, основанном на образовании комплекса «ТФ-VIIa», активирующего добавляемый фактор X, который впоследствии гидролизует хромогенный субстрат с образованием окрашенного я-нитроанилина. Иммуноферментный анализ (ELISA) позволяет определять как общее количество проконвертина и его комплекса с тканевым фактором (VII+VIIa+ТФ/ VII+TФ/VIIa), так и активную форму (VIIa+T/VIIa), которая в норме составляет около 1% (~5 нг/мл).

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 50-200%; при определении методом ELISA - 300-800 нг/мл.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Дополнительная нестабильность результатов в клоттинговом и хромогенном тестах связана с возможностью самопроизвольной и Холодовой активации фактора VII (плазму крови нежелательно долго выдерживать при низкой температуре). Вместе с тем быстрое замораживание плазмы мало изменяет активность данного фактора. Гепарин* в концентрации до 0,5 ЕД/мл не влияет на результаты хромогенного исследования.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества используют аттестованную по фактору VII контрольную плазму, РНП-плазму или свежую (свежеразмороженную) пулированную плазму от нескольких здоровых людей.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора VII возможно при нарушении его синтеза в печени (в периоде новорожденности, при тяжелой патологии органа - гепатите, циррозе, дефиците витамина К и лечении непрямыми антикоагулянтами) и при коагулопатии потребления. Врожденная недостаточность проконвертина встречается очень редко. Повышение активности фактора VII возможно при активации его синтеза в печени (действии эстрогенных препаратов, в III триместре беременности и т. д.).

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Фактор VII отличается наиболее коротким периодом циркуляции в кровеносном русле (Т 1/2=4-7 ч); прогрессирующее снижение его активности может рассматриваться как один из маркеров острой печеночной недостаточности. Повышение количества/активности фактора VII расценивается как тромбофилическое состояние, может сопровождаться возрастанием риска сердечно-сосудистых заболеваний.

Фактор V(активность/количество)
Плазменный фактор V (проакцелерин) синтезируется в печени, в крови циркулирует в неактивном виде, содержится в тромбоцитах. После протеолитической активации фактор Va выступает в качестве основного кофактора фактора Ха, повышая его активность на несколько порядков. В свою очередь, фактор Ха в составе протромбиназного ферментного комплекса (факторов Ха, Va, фосфолипидов и Са2+) вызывает образование тромбина и способствует формированию фибринового сгустка.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Недостаточность фактора V может быть заподозрена в клоттинговом тесте при удлинении ПВ. Показатели приходят к норме в микс-тесте с нормальной донорской плазмой, но остаются патологическими при добавке дефицитной по фактору V плазмы. Клоттинговое определение фактора V аналогично исследованию активности фактора VIII, но проводят по тесту протромбинового времени с использованием субстратной плазмы, дефицитной по фактору V.

Количественное определение проводят ИФА-методом с использованием моноклональных антител к тяжелой цепи фактора V и конъюгата пероксидазы с поликлональными антителами к данному белку. Метод дает представление о количестве, но не о реактивности фактора.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 50-150% уровня нормальной пулированной плазмы.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора V может быть связано с нарушением синтеза в печени (тяжелой патологией печени) или чрезмерным потреблением; врожденный дефицит наблюдается очень редко. Повышение активности фактора V возможно при ускорении его синтеза в печени (острой фазе заболеваний, беременности и т. д.). Исследование проводят для дифференциации причин удлинения протромбинового времени на фоне нормального активированного частичного тромбопластинового времени. Минимальный гемостатический уровень активности фактора V в крови составляет 5-15%, для выполнения операций - 25%.

Фактор XIII (фибриназа, фибринстабилизирующий фактор)
Фибриназа (фактор XIII, трансглутаминаза) путем образования перекрестных ковалентных связей стабилизирует растворимый фибрин-полимерный сгусток и превращает его в плотный тромб. Сгустки, образовавшиеся с участием фибриназы, лизируются медленно. Если же активность фактора XIII снижена, сгустки распадаются быстро, даже когда фибринолитическая активность крови нормальная.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Функциональное определение основано на оценке лизиса фибринового сгустка, образуемого из стандартного раствора фибриногена с добавкой различных разведений исследуемой плазмы, содержащей фактор XIII, в растворе монохлоруксус- ной кислоты (или оксалата мочевины). Метод достаточно субъективен на стадии оценки результатов. Фотометрический энзиматигеский метод основан на действии фактора XIHa, на синтетическом субстрате и определении количества отщепляющихся ионов аммония в глутаматдегидрогеназной реакции на фотометре или биохимическом анализаторе. Иммуноферментный метод (ELISA) на основе поликлональных антител к эпи-топам молекулы фактора XIII высокочувствителен и обладает хорошей воспро-изводимостью. Метод позволяет определять количество фибриназы, но не дает информации об ее активности.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для получения бедной тромбоцитами цитратной плазмы. Плазма должна быть исследована не более чем через 4 ч после взятия крови. Нежелательно исследовать плазму, имеющую сгустки и следы гемолиза. Допустимо однократное замораживание плазмы с последующим оттаиванием в теплой воде.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
К последовательным разведениям исследуемой плазмы буферным раствором (от 1:2 до 1:512) добавляют стандартный раствор фибриногена, суспензию каолина и тромбин-кальциевую смесь. В ходе 30-минутной инкубации при 37 °С образуется сгусток фибрина, в разной степени упрочненный действием фактора XIII. После добавления монохлоруксусной кислоты и 5-минутной инкубации встряхивают пробирки и отмечают наименьшее разведение плазмы, при котором сгусток разрушается на мелкие фибриновые нити. Параллельно тестируют аналогичные разведения входящей в набор плазмы-калибратора с известной активностью фибриназы (в процентах нормальной плазмы). Уровень фактора XIII рассчитывают по наименьшим титрам плазмы, в которых произошел распад сгустка, с учетом известной активности фактора XIII в плазме-калибраторе.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 60-150% уровня нормальной плазмы.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества анализа используют контрольные плазмы с нормальными и патологическими уровнями фактора XIII. Функциональный метод не может быть стандартизирован, поскольку оценка распада сгустка в значительной степени субъективна.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение фактора XIII в крови может быть связано с нарушением его синтеза либо с гиперпотреблением. Активность фибриназы бывает сниженной у новорожденных и детей первого месяца жизни. Приобретенный дефицит фактора XIII может развиваться у больных с лучевой болезнью, лейкозами, гепатитами и циррозами, метастазами опухолей в печень, лимфомой. Описано существенное снижение активности фактора XIII (
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клиническая значимость теста в целом невелика. Снижение или повышение активности фибриназы рассматривают как фактор геморрагического или тромботического риска. Вместе с тем считается, что 10% фибриназы обеспечивают полноценный гемостаз, а 2% этого фактора достаточны для остановки кровотечения.

Владельцы патента RU 2394648:

Группа изобретений относится к медицинской технике и предназначена для определения коагуляции крови. Тест-элемент содержит первую и вторую поверхности, расположенные на заданном расстоянии напротив друг друга. Обе поверхности содержат две по существу одинаковые структуры, образующие конгруэнтные участки с высокой и низкой поверхностной энергией. Участки с высокой поверхностной энергией образуют систему распределения пробы с чувствительными к коагуляции участками. По меньшей мере, один чувствительный участок снабжен, по меньшей мере, одним вызывающим коагуляцию реагентом. Тест-система коагуляции содержит тест-элемент, устройство регистрации, обрабатывающее устройство и устройство отображения. Способ изготовления тест-элемента включает формирование структуры участков с высокой и низкой поверхностной энергией, покрытие, по меньшей мере, одного заранее определенного чувствительного участка, по меньшей мере, одним вызывающим коагуляцию реагентом, наложение слоев первой и второй поверхностей на противоположные участки центрального слоя. Способ определения коагуляции в сыворотке или жидкости пробы цельной крови включает нанесение сыворотки или жидкости пробы цельной крови на тест-элемент коагуляции, введение тест-элемента коагуляции в измерительное устройство, считывание выходных значений с устройства отображения. Устройства и способы позволяют достичь повышения эффективности определения коагуляции цельной крови за счет минимальных этапов: нанесение крови на полоску, автоматический расчет точного результата, включая средство для контроля качества "на полоске"; удешевления способа изготовления тест-элемента коагуляции за счет уменьшения числа сложных этапов. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 14 ил.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к тест-системе коагуляции для измерения коагуляции крови в образце физиологической жидкости.

Предпосылки создания изобретения

Процесс коагуляции крови является сложным и затрагивает большое число компонентов крови, включая образование волокон фибрина. Эти волокна образуются путем полимеризации молекул белка, называемого фибриногеном. Фибриноген образуется при катализе из энзима, называемого тромбином, который сам образуется при катализе из энзима протромбина.

Тест протромбинового времени (ПВ тест) обычно используют в больницах, клиниках и лабораториях для определения способности пробы крови свертываться. Этот тест широко используется для предоперационных оценок и для антикоагуляционной терапии, назначаемой, например, кардиологическим пациентам. ПВ тест основан на продолжительности времени, необходимого для свертывания образца крови под действием некоторых реагентов, таких как ионы кальция и тромбопластин.

Аналогично пациентам, страдающим заболеваниями сердечно-сосудистой системы и (или) с механическими клапанами сердца, часто назначают лечение с ежедневным приемом разжижающих кровь лекарственных средств, обычно называемых антикоагулянтами. Эффективное количество антикоагулянта в крови должно поддерживаться на уровне, который врач считает правильным. Последствия неправильных количеств антикоагулянта в крови тяжелые, приводящие к нарушению мозгового кровообращения или кровотечению.

Для поддержания такого баланса пациенты вынуждены часто, с высокими затратами и неудобством, посещать клинику, в которой можно тщательно контролировать способность крови свертываться. Мониторинг проводят с периодическими измерениями ПВ в соответствии с Международным нормализованным отношением (показатель состояния системы свертывания крови) - MHO. Например, MHO больше 3 приводит к более высокому риску тяжелого кровотечения, в то время как MHO 6 повышает риск развития сильного кровоизлияния почти в 7 раз, чем у пациентов с MHO ниже 3. В противоположность этому, MHO ниже 2 связано с повышенным риском нарушения мозгового кровообращения. Поэтому мониторинг протромбинового времени рекомендован для обеспечения уровней доз в пределах терапевтического диапазона.

Посредством мониторинга таких компонентов, как уровни фибриногена и протромбина в крови, врач может получить значимые данные в отношении свертывания крови пациента или других клинических состояний. Белки, участвующие в процессе свертывания (коагуляции), обычно называют факторами. Факторы пронумерованы I-XIII, и ссылка на фактор по его номеру идентифицирует соответствующий белок для специалистов.

Активация протромбина происходит в результате действия фактора свертывания крови Ха, который образуется за счет активации фактора Х во время протеолиза. Существуют два молекулярных канала, приводящих к активации фактора Х для получения фактора Ха, в основном упоминаемые как наружный и внутренний каналы свертывания крови. При наружном канале используется только тканевый фактор, специфический для поврежденной мембраны, в то время как при внутреннем канале используются только факторы, являющиеся внутренними для циркулирующей крови. Оба эти канала связаны с взаимодействием энзимов, участвующих в процессе свертывания крови, с поверхностными белками и фосфолипидами.

Предложены различные тесты для измерения коагуляции и при наружном, и при внутреннем каналах пробы крови пациента. Например, при тесте активированного частичного тромбопластинового времени (АРТТ) измеряются факторы коагуляции внутреннего канала. Эти факторы включают факторы XII, XI, X, IX, VIII, V, II и I, которые могут быть аномальны вследствие наследственности, заболевания или влияния гепариновой терапии. Таким образом, АРТТ тест полезен в качестве дооперационного скрининга и для мониторинга гепариновой терапии. Аналогично, тест скорости полимеризации фибриногена с использованием теста тромбинового времени (ТВ) или количественного теста фибриногена обеспечивает полезную диагностическую информацию для пациентов при терапии варфарином (торговое название: Кумадин®) или близкими фармацевтическими препаратами.

Как упомянуто выше, наиболее широко используемым тестом для мониторинга антикоагуляционной терапии является одноэтапный тест протромбинового времени. Измеряемая с помощью ПВ теста реакция следующая:

Кровь+Тромбопластин+Са ++ →Сгусток фибрина

Тромбопластин является препаратом фосфолипида-белка, который активирует свертывание в образцах крови. Тромбопластины имеются в продаже от различных изготовителей и могут быть получены из экстрактов легких, мозга или плаценты, а также синтезированы. В основном, значения ПВ для разных лабораторий не совпадают, таким образом, такие значения неприемлемы для определения терапевтических диапазонов для антикоагуляционной терапии.

Поэтому в начале 1980-х годов Всемирной организацией здравоохранения разработано и принято Международное нормализованное отношение (MHO). Нормализованное отношение призвано обеспечить стандартизацию результатов от различных тромбопластинов и привести в соответствие анализаторы коагуляции. Следовательно, под этим отношением изготовитель присваивает Международный индекс чувствительности (МИЧ) каждой партии тромбопластина, который указывает относительную чувствительность тромбопластина по сравнению с международным референтным тромбопластином. Например, если тромбопластин обладает той же чувствительностью, что и референтный тромбопластин, то МИЧ составляет 1,0. Значение МИЧ больше 1,0 указывает, что тромбопластин не является столь же чувствительным, как референтный тромбопластин. Выражение внизу используется для расчета значения MHO с использованием значения ПВ и значения МИЧ:

Среднее нормальное ПВ определено в каждой лаборатории посредством усреднения значений ПВ на число здоровых людей.

Обнаружение образования сгустков фибрина восходит к середине 1850-х годов, и первоначально обнаружение осуществлялось вручную. К 1910 г. был разработан аппарат для определения изменения вязкости пробы крови по мере ее свертывания. Этот аппарат обеспечивал прямую индикацию напряжения, для которого можно было построить график зависимости от времени свертывания. В 1920-е годы стали известны фотоэлектрические методы обнаружения различных изменений коэффициента пропускания света пробы крови во время свертывания с изменением оптического коэффициента пропускания пробы, наблюдаемого с помощью гальванометра. Последующие исследования коагуляции плазмы крови с использованием улучшенных фотоэлектрических методов проводили в середине 1930-х годов с наблюдением возрастания оптической плотности по мере свертывания крови. Это привело к разработке прибора, который показывает возрастающую плотность по мере образования сгустка.

Следовательно, современные системы регистрации оптической плотности работают по принципу того, что возрастание оптической плотности коагулирующей пробы снижает пропускание света через пробу. В типичной системе регистрации оптической плотности исследуемую пробу крови помещают в прозрачную кювету и наблюдают реакцию со стимулирующим коагуляцию реагентом, таким как тромбопластин. Световое или электромагнитное излучение в видимой или близкой инфракрасной области спектра затем пропускали через смесь плазмы-реагента по мере свертывания пробы. Поскольку биохимическое изменение, приводящее к образованию фибрина, происходит внутри пробы, оптическая плотность пробы возрастает. Выходное напряжение, соответствующее оптической плотности пробы, позволяет после обработки с помощью блока обработки, определить коагуляцию пробы.

В то время как давно признано существование взаимосвязи между уровнями фибриногена (фибрина) и оптической плотностью, возникли широкие разногласия в отношении сущности и правильной методологии измерения этой взаимосвязи, и введено множество параметров тестов для определения уровней фибриногена с использованием данных оптической плотности.

Далее, возросшие познания в отношении негативного влияния нерегулярного времени коагуляции крови, принятие самоконтроля и самолечения привело к разработке множества мониторов коагуляции крови и способов персонального использования и диагностики на месте. Однако этим устройствам еще недостает этапа отработки, экономичности и удобства, известных для систем мониторинга уровня глюкозы на дому у пациентов, страдающих диабетом.

Пример способа и системы для измерения времени коагуляции крови описан в патенте US 4252536. Способ включает обеспечение смеси пробы крови и реагента, воздействие на смесь пучка света и регистрацию света, отраженного от смеси, получение представительного электрического сигнала. Затем по электрическому сигналу определяют время, когда происходит наиболее быстрое изменение электрического сигнала, а затем определяют в качестве конечной точки момент времени перед первым временем, когда происходит изменение, которое составляет 1/n от наиболее быстрого изменения, где n больше 1. Большинство способов измерения времени коагуляции основаны на плазме, вводимой в кювету, и на анализе свойств коагуляции за некоторый период времени.

В ЕР 1162457 описана тест-система для определения соответствующего вещества, способствующего коагуляции для назначения пациенту в качестве терапии для улучшения функции свертывания с использованием трех пробирок с пробами для получения нужного количества крови.

В патенте US 6066504 описана система электродов, которая обеспечивает количественное измерение изменений вязкости за некоторые интервалы времени, что является показателем коагуляции или лизиса пробы крови.

В ЕР 974840 описано жидкостное диагностическое устройство для измерения концентрации аналита или свойств биологической жидкости с использованием оптических устройств регистрации.

В WO 20047/044560 описано фотометрическое определение времени коагуляции в неразбавленной цельной крови с емкостью для приема пробы неразбавленной цельной крови, источником для испускания света и фотоприемником для измерения количества света от указанной емкости.

В патенте US 6084660 описано жидкостное медицинское диагностическое устройство, содержащее у одного конца отверстие для введения пробы и у другого конца надувную камеру для всасывания проб в измерительную область, которое измеряет концентрацию аналита или физическое свойство цельной крови, в частности время коагуляции, только после подтверждения того, что проба цельной крови введена в устройство.

В WO 2002/086472 описано использование флуоресцентных молекулярных роторов, у которых меняется интенсивность флуоресценции в зависимости от вязкости среды. Изобретение дополнительно относится к классу молекулярных двигателей, которые при модифицированной углеводородной цепи или гидрофильной группе позволяют измерить вязкость мембраны или жидкости.

В публикациях заявок на патент US 2002/0110486 А1 и US 2003/0031594 А1 описана тест-полоска, содержащая множество зон реакции, используемых для обеспечения качества. Тест-полоска требует объема примерно 20 мкл крови. Однако если пользователь проводит тест часто, как этого требует правильное выполнение коагуляционной терапии, эти большие объемы проб неудобны и являются недостатком.

В заявке РСТ/ЕР 2004/002284 описан тест-элемент с сухим реагентом для фотометрической регистрации и количественного определения аналита, например глюкозы, в физиологической жидкости, например крови, с системой распределения проб по меньшей мере с двумя чувствительными участками, который снабжен встроенной калибровочной системой и который требует очень малых объемов проб примерно 0,5 мкл.

Однако до настоящего времени не существует тест-системы, которая пригодна для измерения коагуляции пробы крови и которая снабжена встроенным устройством контроля качества и требует только малых объемов проб.

Соответственно в основу настоящего изобретения положена задача обеспечить тест-систему для определения коагуляции цельной крови, которая требует только минимальных этапов, таких как нанесение крови на полоску, которая обеспечивает последующий автоматический расчет точного результата теста, включая средство для контроля качества "на полоске", и которая требует только малого количества пробы.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение способа изготовления тест-элемента коагуляции, который не требует большого числа сложных этапов и, следовательно, является недорогим и применимым для изделий, помогающих пациентам выполнять мониторинг коагуляции крови самостоятельно и(или) у врача.

Сущность изобретения

Соответственно, в настоящем изобретении предлагается тест-элемент для определения коагуляции в плазме или пробе цельной крови с первой поверхностью и второй поверхностью на заданном расстоянии друг напротив друга, причем обе поверхности снабжены двумя по существу одинаковыми и конгруэнтно выровненными участками с высокой и низкой поверхностной энергией (поверхностным натяжением), причем участки с высокой поверхностной энергией создают систему распределения пробы, по меньшей мере, с одним чувствительным участком, причем этот чувствительный участок(и) первой и (или) второй поверхностей снабжен, по меньшей мере, одним стимулирующим коагуляцию реагентом.

В настоящем изобретении также предлагается способ изготовления тест-элемента коагуляции.

Кроме того, предлагается тест-система коагуляции, состоящая из тест-элемента коагуляции и измерительного устройства для выполнения анализа коагуляции крови с использованием упрощенного формата для обеспечения достоверного результата в соответствии с мировыми стандартами путем обеспечения контроля качества полоски.

Особенности и преимущества настоящего изобретения будут лучше понятны из следующего подробного описания иллюстративных и предпочтительных вариантов осуществления в сочетании с приложенными чертежами.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показан вид в перспективе одного варианта предлагаемого в настоящем изобретении тест-элемента коагуляции, выполненного в виде тест-полоски;

на фиг.2 показан вид в перспективе варианта осуществления по фиг.1, показывающий распределение пробы в увеличенном масштабе;

на фиг.3 показан вид в перспективе с разбиением на части устройства по фиг.1, показывающий три слоя по отдельности;

на фиг.4 показаны различные формы выреза центрального слоя, образующего полость для пробы вместе с первой и второй поверхностями;

на фиг.5а представлен вид в сечении чувствительного участка системы распределения пробы, созданного гидрофобными направляющими элементами;

на фиг.5б представлен вид в сечении другого варианта осуществления чувствительного участка системы распределения пробы с использованием гидрофильных каналов;

на фиг.6 показаны различные варианты осуществления системы распределения пробы с различными схемами каналов и чувствительных участков, пригодных для различных способов оценки;

на фиг.7а показана система распределения пробы по фиг.5б в сочетании с излучателем света и устройством регистрации на виде в сечении, позволяющие оценить изменения поглощения света пробы;

на фиг.7б показана система распределения пробы по фиг.5б в сочетании с регистрирующим устройством, сконфигурированным для оценки изменений сигнала флуоресценции молекулярного ротора, добавленного к пробе, или для оценки мутности подаваемой жидкости пробы;

на фиг.8 показаны различные молекулярные роторы и их молекулярная структура;

на фиг.9 приведен график, показывающий схематическую оценку результатов коагуляции с использованием положительного и отрицательного контроля качества;

на фиг.10 показан оптический спектр цельной крови в диапазоне от 500 до 700 нм;

на фиг.11 представлен график, показывающий ход реакции коагуляции крови, вызванной Тромборелом С® с мониторингом при 600 нм;

на фиг.12 показана упрощенная блок-схема примера измерительного устройства для использования в предлагаемом в настоящем изобретении способе;

на фиг.13 показано влияние сбоев фиксации во время ламинирования на объем пробы тест-элемента и соответствующий вид сверху в сечении альтернативного варианта осуществления, который обеспечивает большее допустимое отклонение для установки нижнего слоя и верхнего слоя без ущерба для качества тест-полоски;

на фиг.14 показаны этапы изготовления тест-элементов коагуляции с формой полоски.

Подробное описание изобретения

Как показано на фиг.1 и 2, тест-полоска 1 коагуляции по настоящему изобретению представляет собой многослойную структуру, содержащую нижний слой 2, центральный слой 3, расположенный над нижним слоем 2, и верхний слой 4, расположенный над центральным слоем 3. Центральный слой 3 имеет вырез 5, который вместе с нижним слоем 2 и верхним слоем 4 образует внутреннюю полость. Внутри полости расположена система 6 распределения пробы, которая сообщается с расположенным на краю тест-полоски коагуляции участком 9 взятия пробы. Используемый пользователем участок 9 взятия пробы предпочтительно имеет форму скругленного выступа 10, расположенного на одной из главных сторон тест-полоски коагуляции для более простого взятия пробы. На другой главной стороне тест-полоски коагуляции против участка 9, 10 взятия пробы расположено вентиляционное отверстие 11, через которое заполняющая систему распределения проба физиологической жидкости или жидкости на водной основе вытесняет воздух и поступает на заранее определенные чувствительные участки 6а, 6"а (см. фиг.3). Следует отметить, что при этой конструкции необходимо только одно вентиляционное отверстие независимо от количества заранее определенных чувствительных участков, используемых внутри тест-элемента коагуляции. Описанные элементы системы распределения пробы с участками с высокой поверхностной энергией, участком взятия пробы, вентиляционным отверстием, центральным слоем и вырезом в центральном слое образуют собственно тест-элемент коагуляции, который создает внутренний капиллярный эффект, обеспечивающий распределение взятой физиологической жидкости или жидкости на водной основе на заранее определенные чувствительные участки.

Кроме того, тест-полоска 1 коагуляции содержит регистрирующие (позиционирующие) элементы 7, 8, используемые для различения нескольких типов тест-полосок для определения различных параметров, таких как протромбиновое время (ПВ) и активированное частичное тромбопластиновое время (АРТТ). Посредством этого измерительное устройство для нескольких аналитов настроено на выполнение специальной программы или процедур с выбираемыми параметрами при введении полоски для определения различных параметров, как показано на фиг.3, на котором представлена многослойная структура по фиг, 1 и 2 в разобранном виде, причем нижний слой 2 обеспечивает первую поверхность 2а, и верхний слой 4 обеспечивает вторую поверхность 4а. Первая поверхность 2а и вторая поверхность 4а сконструированы с участками, которые создают систему 6 распределения пробы. Структура системы 6 распределения пробы содержит заранее определенное число чувствительных участков 6а и каналов пробы 6b, которые совмещены и зафиксированы в основном конгруэнтно при сборке многослойной структуры. Центральный слой 3 обеспечивает расстояние между первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4 и содержит вырез 5 для создания внутренней полости совместно с первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4. Система 6 распределения пробы, которая образована между первой поверхностью 2а и второй поверхностью 4а, расположена внутри полости, создаваемой вырезом 5 центрального слоя 3 и первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4. Предпочтительно внутренняя полость конструктивно по существу больше, чем система распределения пробы.

Поскольку назначение выреза 5 центрального слоя состоит только в создании полости для системы 6 распределения пробы, вырез 5 центрального слоя 3 может иметь различную форму; примеры показаны на фиг.4. На фиг.4а показана полость 12 тест-элемента коагуляции в форме зонтика. На фиг.4б показана прямоугольная полость 13 тест-элемента коагуляции, и на фиг.4с полость 14 для пробы имеет круглую форму. Вырез 5 центрального слоя 3 не влияет на размер заранее определенных чувствительных участков 6а и размер каналов 6b системы 6 распределения пробы и, следовательно, не влияет или не меняет требуемый объем пробы. По сравнению с системой 6 распределения пробы форма полости, показанная на фиг.4, довольно проста, таким образом обеспечивается использование простых пробивных штампов и быстрая обработка с меньшими требованиями по точности установки.

Система 6 распределения пробы, расположенная в полости, образованной вырезом 5 центрального слоя 3 и первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4, образована за счет создания участков с высокой и низкой поверхностной энергией на указанных поверхностях 2а и 4а. Участки с высокой и низкой поверхностной энергией на первой поверхности 2а нижнего слоя 2 и второй поверхности 4а верхнего слоя 4 совмещены по существу конгруэнтно друг относительно друга. Поскольку нанесенная физиологическая жидкость или любая другая проба на водной основе смачивает только участки с высокой поверхностной энергией, таким образом, она ограничена в пределах заранее определенных каналов 6b потока и чувствительных участков 6а системы 6 распределения пробы и между первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4.

На фиг.5а показана конструкция системы 6 распределения пробы с использованием гидрофобных "направляющих элементов". В этом варианте осуществления тест-элемента коагуляции по настоящему изобретению нижний слой 2 и верхний слой 4 покрыты гидрофобным слоем 16, за исключением участков, которые образуют каналы пробы, и чувствительных участков. Гидрофобный слой 16 создает участок с низкой поверхностной энергией, который проявляет силу отталкивания по отношению к нанесенной жидкости 15 пробы и, следовательно, ограничивает жидкость 15 пробы участками с высокой поверхностной энергией, которые образуют систему 6 распределения пробы.

Предпочтительно гидрофобный слой наносится на гидрофильную поверхность, которая смачивается физиологической жидкостью или жидкостью на водной основе. Описанная выше процедура требует наличия гидрофильной поверхности, которую можно изготовить из натурального гидрофильного полимера, такого как целлофан или стекло, а также на основе гидрофобных поверхностей общих полимеров (примеры приведены ниже), придав гидрофобной поверхности гидрофильные свойства с использованием покрытия или физического или химического плазменного осаждения гидрофильных мономеров, которые можно испарить в вакууме, например диоксид кремния, оксид этилена, этилен гликоль, пиррол или акриловая кислота. Следовательно, структура "направляющих элементов" может быть реализована печатью гидрофобной краски на гидрофильные поверхности нижнего и верхнего слоев.

Пригодная гидрофобная краска обладает углом смачивания с водой обычно больше 100° и поверхностной энергией обычно менее 25 мН/м и обычно содержит мономеры, олигомеры и полимеры с гидрофобными свойствами, придающие гидрофобные свойства добавки или гидрофобные пигменты и наполнители.

На фиг.5б показана другая конструкция системы распределения пробы с использованием гидрофильных каналов. В этом варианте осуществления тест-элемента коагуляции нижний слой 2 и верхний слой 4 покрыты гидрофильным слоем 17, создавая, тем самым, участки с высокой поверхностной энергией.

Гидрофильный слой 17, нанесенный печатью на гидрофобную поверхность, сильно смачивается физиологической жидкостью или жидкостью на водной основе; таким образом, участки с высокой поверхностной энергией, создающие гидрофильные каналы системы распределения пробы, оказывают воздействие положительной капиллярной силы на нанесенную физиологическую жидкость или жидкость пробы на водной основе, чтобы передать жидкость пробы на отдельные чувствительные участки.

Гидрофильный слой 17 может быть реализован путем печати гидрофильных или амфифильных реагентов на гидрофобную поверхность. Краски с гидрофильными свойствами могут быть выбраны из широкого ряда растворимых в воде и спирте полимеров с высокой молекулярной массой и их смесей. В частности, пригодны производные альгинатов, целлюлозы, гидроксиэтил целлюлозы, смол, многоатомных спиртов, полиэтиленгликолей, оксидов полиэтилена, винилпиролидона, сульфонатов полистирола, полисульфонатов, производных алкил-фосфохолина и других; в частности, пригодны также органо-модифицированные акрилаты кремния, которые являются перекрестно-сшитым видом органо-модифицированных поликсилоксанов и фторированных поверхностно-активных веществ. Пригодные покрытия обеспечивают угол смачивания с водой обычно менее 35° и поверхностную энергию обычно более 50 мН/м.

Нижний слой и верхний слой, пригодные в качестве подложки для печати, могут быть созданы из материала типа стекла, поливинил ацетата, полиметилметакрилата, полидиметилсилоксана, сложных полиэфиров полиэфирных смол, содержащих кольца флюорена, полистиролы, поликарбонаты и привитые сополимеры поликарбоната-полистирола, концевые модифицированные поликарбонаты, полиолефины, циклоолефины и сополимеры циклоолефинов и(или) сополимеры олефина-малеинимида.

В случае, когда подложка относится к промежуточному гидрофобному типу, также возможно нанесение печатью гидрофильных каналов с окружающей гидрофобной структурой, т.е. комбинация конструкций по фиг.5а и фиг.5б.

В альтернативном варианте осуществления (не показан) либо первая, либо вторая поверхность предусмотрена с гидрофильной/гидрофобной структурой и соответствующая поверхность обеспечивает гомогенную структуру гидрофильных пикселей, окруженных гидрофобным участком, создавая тем самым поверхность с полугидрофильными, полугидрофобными свойствами (амфифильный характер поверхности), что устраняет необходимость совмещения гидрофильной и гидрофобной структур первой поверхности с эквивалентной гидрофильной и гидрофобной структурой второй поверхности. Свойства такой амфифильной поверхности можно легко спроектировать посредством геометрической структуры гидрофильных пикселов и общего соотношения между гидрофильным и гидрофобным участком. В данном варианте осуществления изобретения амфифильный характер, соответственно, соотношение между гидрофильными пикселями и гидрофобными участками, заданы такими, чтобы жидкость пробы проходила от гидрофильного пикселя к гидрофильному пикселю, только если противоположная поверхность обеспечивает гидрофильный характер. Если противоположная поверхность обеспечивает гидрофобный характер, движение жидкости внутри капиллярного зазора тест-элемента коагуляции прекращается. Этот механизм позволяет создавать по вышеописанному способу функциональный тест-элемент коагуляции без строгого требования точного позиционирования соответствующей структуры системы распределения пробы, предусмотренной на первой и второй поверхностях. Однако предпочтительно, чтобы и первая, и вторая поверхности были предусмотрены с одинаковыми структурами с высокой и низкой поверхностной энергией для обеспечения быстрого распределения жидкости пробы внутри гидрофильных каналов системы распределения пробы.

Более того, можно физически поднять участки с высокой поверхностной энергией первой и второй поверхностей относительно участков с низкой поверхностной энергией за счет травления, тиснения или просто печати гидрофильного слоя толщиной больше примерно в три-пять раз на первой и второй поверхности. Благодаря этому подъему капиллярный зазор гидрофильных каналов становится меньше относительно окружающего участка и оказывает более сильное воздействие капилляров на жидкость пробы.

Требования к объему для системы распределения пробы, содержащейся в тест-элементе коагуляции по предпочтительному варианту осуществления, очень низкие и составляют примерно 0,5 мкл-1,0 мкл, так что требуется примерно только 100 нл-150 нл на чувствительный участок, в зависимости от того, созданы ли участки с высокой и низкой поверхностной энергией гидрофобными направляющими элементами или гидрофильными каналами или их комбинацией. Однако для специалистов будет очевидно, что объем системы распределения пробы различен для различных конструкций и в зависимости от числа использованных заранее определенных чувствительных участков.

На фиг.6 показаны различные структуры системы распределения пробы, которые можно осуществить посредством гидрофильных каналов, как показано на фиг.5б, или посредством гидрофобных "направляющих элементов", как показано на фиг.5а, или посредством комбинации гидрофильных каналов и гидрофобных направляющих элементов. Выбранная система распределения пробы должна соответствовать оцениваемому выбранному физиологическому параметру и используемому химическому способу регистрации.

Таким образом, повтор измерений пробы и стандарта возможен для конкретных проб сыворотки или цельной крови по вариантам осуществления, показанным в рядах со II по IV. Аналогично этому, можно использовать тест-элемент коагуляции, предусмотренный в ряду IV для оценки двух параметров коагуляции, таких как протромбиновое время и активированное частичное тромбиновое время.

Как описано выше, образование сгустка фибрина зависит от реакции между тромбопластином и ионами кальция, вступающими в реакцию с кровью, как указано ниже (Реакция I):

Тромбопластин+Са ++ +Кровь (или Плазма)→Сгусток фибрина

При реакции (1) чувствительные участки 6"а системы 6 распределения пробы первой поверхности 2а нижнего слоя 2 или второй поверхности 4а верхнего слоя 4 характеризуются тем, что они покрыты составом 18, 19, как показано на фиг.5а и 5б, который способствует и обеспечивает регистрацию реакции коагуляции в пробе крови.

В одном варианте осуществления тест-элемента по настоящему изобретению состав 18 содержит вызывающий коагуляцию реагент, такой как Тромбопластин (например, предлагаемый компанией Dade Behring Holding GmbH, Höchster Strasse 70, 65835 Liederbach, Германия), в то время как состав 19 содержит ионы кальция. Вызывающий коагуляцию реагент является ускорителем коагуляции крови на чувствительном участке, позволяя, таким образом, зарегистрировать оптические свойства с помощью фотометрии пропускания или поглощения или рассеяния света.

Протромбиновое время или активированное частичное тромбиновое время можно регистрировать путем изменения поглощения света или рассеяния света. Во время коагуляции фибриноген преобразуется в фибрин, что вызывает преждевременное произвольное распределение эритроцитов и тромбоцитов в наиболее связанной стадии, таким образом, эритроциты и тромбоциты будут захвачены и соединены с волокнами фибрина и друг с другом, образуя сгусток крови. Эти изменения физической консистенции пробы крови приводят к сокращению числа центров рассеяния и, следовательно, к изменению поглощения света и мутности исследуемой пробы крови. Для оценки изменения поглощения света используется конструкция регистрирующего устройства, показанная на фиг.7а.

На фиг.7а показана конструкция регистрирующего устройства для измерения оптической плотности пробы внутри тест-элемента коагуляции по фиг.5б. Эта конструкция содержит источник 20 света, который испускает свет 24 некоторой длины волны в направлении чувствительного к пробе участка. Свет, испускаемый источником 20 света, проходит через оптическую схему 21, например диффузор или линзу, и апертуру 22, нижний слой 2, пробу 15 и верхний слой 4 чувствительного участка и регистрируется на противоположной стороне прибора регистрирующим устройством 23.

В другом варианте осуществления тест-элемент коагуляции предназначен для выполнения нескольких определений для обеспечения дополнительных измерений контроля качества. В этом случае тест-элемент коагуляции имеет по меньшей мере два, предпочтительно три чувствительных к коагуляции участка. Предпочтительно все чувствительные участки 6"а на первой поверхности 2а покрыты вызывающим коагуляцию реагентом 18 (например, тромбином), ускоряющим реакцию между химическими компонентами для образования сгустка фибрина, между тем как чувствительный к пробе участок, например 6а2, второй поверхности 4а покрыт химическим составом, содержащим ускоритель коагуляции, способствующий быстрой и полной коагуляции (положительный контроль), и другой чувствительный участок, например 6а3, второй поверхности 4а покрыт химическим составом, содержащим ингибитор коагуляции, подавляющий коагуляцию крови (отрицательный контроль).

При реакции (1) количества тромбопластина, ионов кальция и, если это необходимо, состава контроля качества, такого как ингибитор или ускоритель коагуляции, точно дозируют на указанных чувствительных к пробе участках. Предпочтительно дозирование выполняется способом осаждения с дозированием, хотя другие способы, такие как струйная печать, известны специалистам. Точное дозирование вызывающего коагуляцию реагента, нанесенного на чувствительные к пробе участки, критично для правильной процедуры реакции и, таким образом, для надежного расчета конечной точки реакции коагуляции. Например, в примере варианта осуществления количество тромбопластина может быть постоянным на каждом чувствительном к пробе участке, в то время как концентрация ингибитора коагуляции, такого как этилендиаминтетрауксусная кислота, может меняться.

В другом варианте осуществления тест-элемента по настоящему изобретению кроме дозирования тромбопластина, ионов кальция и составов контроля качества, таких как ингибитор и ускоритель коагуляции, дополнительный компонент, который действует как вспомогательная добавка для регистрации флуоресценции, может быть нанесен на чувствительные к пробе участки первой и(или) второй поверхности(ей) 2а, 4а. Если указанные чувствительные участки снабжены так называемыми флуоресцентными молекулярными роторами, реакцию коагуляции можно контролировать по флуоресценции.

Флуоресценция - это испускание света каким-либо веществом, которое происходит из первого возбужденного состояния молекулы. При инициализации такая молекула возбуждается за счет поглощения света. В течение следующих нескольких наносекунд молекула возвращается в основное состояние и освобождается от энергии возбуждения либо путем испускания света, называемого флуоресценцией, либо путем перемещения и вращения основной цепи молекулы.

Флуоресценция обычно возникает у ароматических молекул. Ароматические молекулы, поглощающие видимый свет в диапазоне от 400 до 800 нм, кажутся цветными. Более того, хромофор является частью краски, определяющей свойства поглощения и испускания всей молекулы. Количество или интенсивность испускания конкретного хромофора оценивается количественно по его квантовому выходу флуоресценции. Квантовый выход флуоресценции определяется как число испущенных фотонов по отношению к числу поглощенных фотонов. Широкий диапазон обычно используемых флуоресцентных красок обладает фиксированным квантовым выходом, тем самым, все краски с большим квантовым выходом, достигающим 100% эффективности испускания, обнаруживают наиболее яркое испускание, например сульфородамин 101, также известный как Texas Red.

Краски, несущие гибкие группы на конце их хромофора, известны как молекулярные роторы и обнаруживают зависимость их квантового выхода флуоресценции от вязкости растворителя. По мере того как вязкость растворителя возрастает, квантовый выход флуоресценции этих красок также возрастает. Это можно отнести за счет подвижности подвижных нежестких групп на конце хромофора, которая снижается при увеличении вязкости. Чем больше замедляется подвижность боковых групп, присоединенных к хромофору, тем больше молекул краски не могут перейти в свое основное состояние посредством перемещений их молекулярного каркаса и освободиться от энергии возбуждения посредством испускания света. Примеры флуоресцентных красок, чувствительных к вязкости растворителя, можно найти в классе красок на основе ксантина, оксазина и карбопиронина.

Этот эффект можно отнести за счет подвижности диэтиламиновых групп, которая снижается при возрастании вязкости. Одним примером такой краски в классе ксантина является родамин В, который может быть показан в виде следующей химической структуры:

Нижеследующая химическая структура показана в качестве примера подвижности диэтиламиновых групп, которая, соответственно, снижается за счет контакта с реагентами реакции 1. Поскольку эти реагенты приводят к образованию сгустка фибрина, т.е. коагуляции физиологической жидкости, возрастает вязкость пробы и, следовательно, флуоресценция молекул. Отмеченные диэтиламино-группы на конце хромофора не являются жесткими и вращаются, как отмечено, вокруг связи. Так как это движение сильно замедляется при повышении вязкости из-за коагуляции, испускание флуоресценции краски возрастает.

В отношении настоящего изобретения флуоресцентные пробы, чувствительные к изменению вязкости, наиболее полезны. Другими примерами молекулярных роторов являются орамин О., кристаллический фиолет 4, р-N,N-диметиламинобензонитрил 5, p-N,N-диметиламинобензонитрил 6, юлолидинбензилиденмалононитрил, родамин 19, родамин G6, родамин В, оксазин 1, оксазин 4, оксазин 170. Их молекулярная структура показана на фиг.8.

В случае мониторинга реакции по флуоресценции наиболее полезно расположить источник света и регистрирующее устройство не напротив друг друга, а под углом приблизительно 90 градусов для достижения максимальной чувствительности, как показано на фиг.7б. Предпочтительный угол между источником света и регистрирующим устройством составляет от 80 до 120 градусов, но наиболее предпочтителен угол приблизительно 109 градусов и размещение тест-системы коагуляции в оптической регистрирующей схеме таким образом, чтобы угол между нижним слоем и источником света и угол между верхним слоем и регистрирующим устройством составлял приблизительно 54 градуса во избежание фонового шума, обусловленного внутренним отражением на различных поверхностях чувствительного участка (или, в основном, тест-системы коагуляции). Для полного использования указанное регистрирующее устройство 23 сконфигурировано помимо оптической схемы 21 и 22 с оптическими фильтрами 21а и 22а для различения длины волны возбуждения и испускания, таким образом, регистрирующее устройств "видит" только свет 24, испускаемый от флуоресцентной краски, и "не видит" свет 24а, испускаемый источником света. Тем не менее, специалист заметит, что фактический угол должен быть оптимизирован для конкретного применения, требуемой чувствительности и требований к измерительному устройству в отношении регистрирующего устройства.

Тест-элемент 1 коагуляции содержит по меньшей мере один чувствительный участок 6а, который необходим для точного измерения протромбинового времени, но в предпочтительном варианте осуществления можно использовать три чувствительных участка 6а1-6а3. Физическая компоновка тест-элемента 1 коагуляции обеспечивает гибкость в отношении состава соединений, наносимых на различные чувствительные участки. Например, чувствительные участки 6а-6с могут иметь различную концентрацию вызывающего коагуляцию реагента, такого как тромбопластин, нанесенный на первую поверхность 2а нижнего слоя 2, в то время как ионы кальция и флуоресцентный молекулярный ротор могут быть нанесены на вторую поверхность 4а верхнего слоя 4. В альтернативном варианте все реагенты могут быть нанесены либо на первую поверхность 2а нижнего слоя 2, либо на вторую поверхность 4а верхнего слоя 4 тест-элемента 1 коагуляции.

После того как физиологическая жидкость, такая как кровь или плазма, нанесена на участок 9 взятия пробы и распределена на чувствительные участки под воздействием капилляров, она растворяет вызывающий коагуляцию реагент, содержащийся в составе 18 на чувствительных участках первой поверхности 2а, а также молекулярный ротор и(или) потенциальный ингибитор коагуляции, такой как этилендиаминотетрауксусная кислота, и содержащийся в составе 19 на заранее определенных чувствительных участках второй поверхности 4а, образуя смесь крови или плазмы, и вызывающего коагуляцию реагента, такого как тромбопластин, и ионы кальция плюс дополнительные материалы, предусмотренные на второй поверхности.

Предпочтительно, чтобы вызывающие коагуляцию реагенты, нанесенные на заранее определенные чувствительные участки, были хорошо растворимы физиологической жидкостью, такой как кровь, и расположены близко друг к другу, чтобы обеспечивать быстрое диффузионное смешивание всех компонентов, обеспечивая, таким образом, быструю реакцию компонентов, содержащихся на чувствительных участках для ускорения быстрого фотометрического определения вызывающей коагуляцию реакции.

Если имеется больше двух, предпочтительно трех, чувствительных к пробе участков, расположенных в пределах системы распределения пробы, один, например 6а1, может быть использован для регистрации протромбинового времени или активированного частичного тромбопластинового времени. Дополнительный чувствительный к пробе участок, например 6а2, может быть конфигурирован для обеспечения отрицательного контроля с использованием ингибитора коагуляции на второй поверхности 4а или отсутствия вызывающего коагуляцию реагента на первой поверхности 2а, тем самым дополнительный чувствительный к пробе участок, например 6а3, может быть конфигурирован для обеспечения положительного контроля с использованием ускорителя коагуляции, например гелеобразующее средство воспроизводит коагуляцию крови, даже если кровь слабо коагулирует. Таким образом, устройство обработки измерительного устройства позволяет сравнить результат измерений пробы с двумя предусмотренными стандартами, обеспечивая ясное решение или индикацию ошибочного измерения.

На фиг.9 показана схематическая оценка и измерение времени коагуляции с использованием молекулярного ротора в качестве флуоресцентной пробы и вспомогательного средства регистрации. На чертеже также показано сравнение сигнала измерения относительно пробы крови 27 с положительным стандартом 26, обеспечивающим максимальную флуоресценцию, достижимую после полного образования сгустка крови, и сравнение с отрицательным стандартом 25, обеспечивающим минимальный сигнал флуоресценции относительно некоагулированной пробы крови. После нанесения пробы цельной крови на участок 9 взятия пробы проба 15 крови переносится под действием капилляров, создаваемым системой распределения пробы, на различные чувствительные к пробе участки 6а/6"а, показанные на фиг.3. Проба растворяет вызывающий коагуляцию реагент, предусмотренный на первой поверхности 2а нижнего слоя 2, обеспечивая начало реакции коагуляции сразу после заполнения чувствительного к пробе участка 6"а1. Блок регистрации измерительного устройства регистрирует введение пробы крови, таким образом, может быть запущено устройство обработки блока регистрации, чтобы выполнить оценку времени реакции коагуляции.

Как упомянуто выше, один чувствительный к пробе участок, например 6а2, может быть конфигурирован как отрицательный стандарт, обеспечивающий средство сравнения измеренного сигнала пробы крови на чувствительном к пробе участке 6а1 с измеренным сигналом пробы крови, показывающим отсутствие реакции коагуляции. Такое поведение достигается либо осаждением не вызывающего коагуляцию реагента на чувствительном к пробе участке 6"а2, либо осаждением ингибитора коагуляции на чувствительном к пробе участке 6а2. Типичными ингибиторами коагуляции являются гепарин лития и натрия и, соответственно, соль калия этилендиаминотетрауксусной кислоты.

С другой стороны, положительный стандарт может быть осуществлен посредством ускорения реакции коагуляции или путем воспроизведения вязкости полностью сформировавшегося сгустка крови с другим сшивающим реагентом, который обеспечивает более быстрое время реакции, чем непатогенная проба крови, таким образом, положительное референтное значение достигается до коагуляции пробы крови на чувствительном участке 6а1. Этот тип перекрестной сшивки может быть достигнут за счет правильной концентрации альгината на второй поверхности 4а второго слоя 4. Альгинат смешивают с кровью и начинают желатинизировать, соответственно при коагуляции в результате реакции с ионами кальция внутри пробы крови и(или) дополнительными ионами кальция, предусмотренными на первой поверхности нижнего слоя. Однако специалисты в этой области понимают, что могут быть использованы другие гелеобразующие средства, также применимые для этой реакции.

Во время реакций устройство обработки измерительного блока может сравнивать отсчеты чувствительного к пробе участка 6а1 с отрицательным стандартом 25 и положительным стандартом 26. Как только измеренный сигнал пробы крови, обеспечиваемый чувствительным к пробе участком 6а1, достигает той же величины, что и положительный стандарт (указан выноской 28 на фиг.9), блок обработки измерительного устройства может остановить таймер и оценить конечный результат. Дополнительно блок обработки может выполнить некоторые дополнительные проверки качества для подтверждения правильности выполнения анализа и обеспечения значимых данных для пользователя/пациента. В этом отношении блок обработки может сравнивать фактические измеренные значения положительного и отрицательного стандартов, которые необходимо разделить посредством минимального и заранее запрограммированного значения. Если величина обоих сигналов становится мала, устройство может выдать сообщение об ошибке, указывающее, что определение неуспешно. Дополнительно это устройство может рассчитывать наклон 27 реакции коагуляции и сравнивать его с некоторыми заранее запрограммированными физиологическими значениями, которые описывают наиболее экстремальные значения, наблюдаемые клиницистами.

При мониторинге мутности пробы в широком диапазоне спектра, например путем использования галогенной лампы в качестве источника света, полезно ограничить окно мониторинга узкой частью спектра, если изменения пробы наблюдают по поглощению света. На фиг.10 показан спектр цельной крови в диапазоне от 500 до 700 нм. Распространенной особенностью спектра является двойной пик 40 гемоглобина между 520 и 600 нм. В принципе, можно оценить ход реакции коагуляции по поглощению света в любом месте в предусмотренной области спектра цельной крови. Требования к техническому измерительному устройству менее жесткие, если мониторинг реакции осуществляется при длине волны вне диапазона поглощения гемоглобина, т.е. 600 нм, как указано ссылочным номером 41.

На фиг.11 приводится пример оценки при обеспечении реакции коагуляции по поглощению света при 600 нм. Кровь вводится в тест-элемент коагуляции через отверстие 9 для нанесения пробы, и пропускание света быстро снижается, а поглощение света, соответственно, быстро возрастает, как указано номером 42. Следовательно, состав для коагуляции, предусмотренный на чувствительных к пробе участках 6"а первой поверхности 2а нижнего слоя 2, растворяется, и реакция коагуляции инициируется за счет реакции тканевого фактора (тканевой тромбопластин) с кровью или плазмой пробы. Этот момент времени определен как t=0, и блок обработки запускает запись результатов измерений. Период времени между событиями 42 и 43 можно считать фазой задержки реакции, когда достигается полное растворение реагентов и смешивание с пробой крови или плазмы, и тканевой тромбопластин запускает серию факторов коагуляции наружного канала, показанную в последовательности активации фактора VII, фактора X, фактора V, фактора II. Последние этапы последовательности коагуляции можно контролировать между событиями 43 и 44, когда фибриноген преобразуется в фибрин. Часто сгусток фибрина нестабилен и начинает разрушаться после достижения плато 44. Скорость и степень разрушения зависят от количества волокон фибрина в сгустке и различны для разных пациентов. Обычно пробы крови с высокой вязкостью обнаруживают более медленное разрушение, чем пробы крови с низкой вязкостью.

Результат измерений, в основном, и результат протромбинового времени по приведенному выше примеру следует оценивать между событиями 42-43, указывающими период времени t 1 , и между событиями 43-44, указывающими период времени t 2 , в основном, в соответствии с уравнением 1:

Факторы а и b необходимы, чтобы получить пропорциональные весовые множители для периодов времени t 1 и t 2 , которые дают вклад в различные пропорции результата ПВ, задаваемого функцией fPT. Таким образом, на t 1 больше влияет тип инертных компонентов коагуляционного состава, который управляет растворением тканевого фактора, на t 2 в наибольшей степени влияет активность самого примененного тканевого фактора и концентрация ионов кальция. Дополнительно оба периода времени t 1 и t 2 модулируются температурой реакции, которая в идеале должна быть установлена или близка к 37°С, режимы более низких температур увеличивают время коагуляции. Однако для малогабаритных устройств следует находить оптимальное соотношение между портативностью, энергопотреблением и лабораторными характеристиками.

На фиг.12 показана упрощенная блок-схема измерительного устройства 80 для использования в настоящем изобретении. Измерительное устройство 80 может быть спроектировано на базе блока обработки, такого как микроконтроллер MAXQ2000 (предлагаемый компанией Dallas Semiconductor Corporation, 4401 South Beltwood Parkway,

Даллас, Техас, США). Блок обработки 81 может выполнять следующие функции контроля: (1) таймер всей системы; (2) обработка данных устройства регистрации света; (3) расчет времени ПВ по измеренным данным и (4) вывод времени ПВ или значения MHO на дисплей 83. Схема памяти позволяет сохранять данные и рабочую программу блока обработки. Дисплей 83 может иметь различный вид, такой как жидкокристаллический или светодиодный дисплей. Измерительное устройство 80 также может включать кнопку пуска-останова и может обеспечивать звуковой или визуальный вывод времени для индикации нанесения проб, считывания показаний и т.д., если это необходимо.

Блок 81 обработки может быть запрограммирован для использования в сочетании с измерительным устройством 80 измерения коагуляции. Свет, испущенный источником 20 света, проходит через оптическое устройство 21 и регистрируется регистрирующим устройством 23. Программа блока 81 обработки может дополнительно включать алгоритм расчета времени коагуляции как Международного нормализованного отношения, сформулированный в середине 1980-х годов, чтобы стандартизировать значения ПВ таким образом, чтобы результаты от различных тромбопластинов и анализаторов коагуляции были одинаковы. Ниже приводится Уравнение 2:

где МИЧ - Международный индекс чувствительности, ПВ пациента - время коагуляции пробы крови пациента, среднее нормальное ПВ - среднее ПВ время примерно для 20 людей. Значение МИЧ дано различными изготовителями тромбопластина.

Способ с использованием тест-элемента 1 коагуляции по настоящему изобретению может быть отнесен к блок-схеме измерительного устройства, показанного на фиг.12. Пользователь вводит тест-элемент 1 коагуляции в держатель 82 полоски измерительного устройства 80, который автоматически приводится в действие посредством запуска нажимной кнопки, которая может быть встроена в него. Регистрирующие (позиционирующие) элементы, расположенные на элементе 1, взаимодействуют с регистрирующими элементами на держателе 82 полоски для обеспечения расположения элемента 1 в правильном положении. Такое правильное расположение элемента крайне важно для действия комбинации измерительного устройства 80 и полоски 1. Необязательно измерительное устройство 80 может быть приведено в действие пользователем нажатием кнопки. Соответственно, пользователь делает прокол пальца и наносит цельную кровь на участок 9 нанесения пробы вставленного тест-элемента 1 коагуляции.

Объем крови, необходимой для выполнения теста по настоящему изобретению, составляет примерно 1 мкл. Поскольку гидрофильный реагент, нанесенный печатью на гидрофобную поверхность, сильно смачивается физиологической или водной жидкостью, участки с высокой поверхностной энергией, создающие гидрофильные каналы системы распределения пробы, вызывают положительную силу воздействия капилляров на нанесенную физиологическую жидкость пробы для перенесения жидкости пробы на отдельные чувствительные участки. Следовательно, физиологическая проба быстро распределяется на каждый чувствительный к пробе участок (6а-с) и активирует на нем вызывающие коагуляцию реагенты.

Затем начинается время теста коагуляции, поскольку реагент на чувствительных участках 6а-6с способствует коагуляции, и оптические свойства меняются, чтобы привести к моменту осуществления коагуляции.

Способ изготовления тест-элемента коагуляции

Тест-элемент коагуляции по настоящему изобретению, который предпочтительно изготовлен в виде полоски, можно легко изготовить по методам, известным специалистам в этой области, посредством печати, использования пробивных штампов и ламинирования. Конструкция тест-элемента коагуляции обеспечивает простой и затрато-эффективный способ, который предпочтительно, но необязательно, может быть непрерывным.

На первом этапе способа изготовления структура систему 6 распределения пробы образуют созданием участков с высокой и низкой поверхностной энергией на подложке. В первом варианте осуществления участки с высокой поверхностной энергией, образующие каналы 6b пробы и чувствительные участки 6а, 6"а на первой и второй поверхностях 2а, 4а, создаются нанесением гидрофильного состава на гидрофобную поверхность подложки. Как подробно описано выше, также можно создать участки с высокой и низкой поверхностной энергией нанесением структуры гидрофобных "направляющих элементов" на гидрофильную поверхность. В предпочтительном случае подложка обладает промежуточными гидрофобными свойствами имеющихся в продаже прозрачных полимерных пленок, посредством чего участки с низкой и высокой поверхностной энергией системы распределения пробы и чувствительных к пробе участков созданы печатью гидрофильных каналов под или окруженных гидрофобной структурой гидрофобных направляющих элементов.

Подложка может быть образована из материала типа стекла, поливинил ацетата, полиметилметакрилата, полидиметилсилоксана, полистиролов, сложных полиэфиров и полиэфирных смол, содержащих кольца флюорена, поликарбонаты и привитые сополимеры поликарбоната-полистирола, концевые модифицированные поликарбонаты, полиолефины, циклоолефины и сополимеры циклоолефинов и(или) сополимеры олефина-малеинимида.

Нанесение гидрофильной структуры на гидрофобную подложку и(или) нанесение гидрофобных "направляющих элементов" на гидрофильную подложку или любое их сочетание может быть выполнено по способу флексографии, литографии, глубокой печати, способов переноса на основу твердого красителя или струйной печати.

Однако предпочтительным способом изготовления является способ флексографии, который позволяет выполнить печать с высоким разрешением на ротационных печатных машинах и обеспечивает высокую производительность. Этот способ широко применяют для печати на полимерных пленках и повсеместно используют в упаковочной промышленности. Способ оптической регистрации требует прозрачной и чистой краски с низкой вязкостью для гидрофильной структуры. Краски с низкой вязкостью предпочтительны для получения тонкого и ровного покрытия толщиной примерно 2-4 микрона. Оптическое окно спектра краски должно находиться в диапазоне длин волны, пригодном для оптической регистрации химической реакции. Требования к гидрофобной краске, помимо гидрофобных свойств, менее строгие, и ее можно использовать также для украшения тест-элемента коагуляции нужным цветом, таким образом, для этого этапа предпочтительна непрозрачная краска. Использование четырехцветной машины для флексографической печати получило широкое распространение, и их использование, по существу, не создает проблем. То же относится к литографическому устройству.

Наиболее пригодны для изготовления тест-элемента коагуляции краски на базе растворителя, широко представленные различными изготовителями. Дополнительно, все имеющиеся печатные краски можно подбирать с дополнительными добавками и пигментами для оптимизации требуемых параметров. Многие из этих красок основаны на смесях нитроцеллюлозного этанола или поливинил бутирал этанола и могут быть получены, например, в компании Sun Chemicals Inc. (35 Waterview Boulevard, Parsippany, Нью-Йорк, США) или Flint Ink Inc. (4600 Arrowhead Drive, Ann Arbor, Мичиган, США).

Хотя краски на основе растворителя или закрепляемые под действием ультрафиолетового излучения применимы для изготовления тест-элемента коагуляции, некоторыми предпочтительными свойствами обладают краски, закрепляемые пучком электронов (ЭП). Эти краски обеспечивают самое высокое сопротивление механическим и химическим факторам и содержат 100% полимеров, необязательно с пигментами, но без летучих органических растворителей и фотоингибиторов, которые, как доказано, влияют на стабильность при использовании сенсоров. Эти положительные достижения в улучшении характеристик получены за счет способности электронов создавать сшитые полимерные пленки и проникать вглубь поверхности.

Печатные краски, которые закрепляются в пучке электронов, позволяют использовать способность акриловых мономеров и олигомеров к полимеризации. Использование акриловых соединений для приготовления печатных красок в настоящее время становится все более актуальным (см. J.T.Kunjappu. "The Emergence of Polyacrylates in Ink Chemistry," Ink World, февраль, 1999 г., стр.40.) Простейшее акриловое соединение, а именно акриловая кислота, имеет следующую формулу (I):

Двойная связь в акриловом фрагменте при взаимодействии с электронами (инициация) раскрывается и образует свободный радикал, в результате взаимодействия которого с другими образующими цепь (развитие цепи) мономерами образуются высокомолекулярные полимеры. Как уже было отмечено выше, радиационная полимеризация не требует никакого внешнего инициатора, поскольку излучение высокой энергии само генерирует свободные радикалы, благодаря чему в покрытии не остается никаких остатков инициаторов.

К акриловым мономерам, которые закрепляются в потоке электронов, относится большое количество акриловых мономеров, начиная от простых акрилатов типа 2-феноксиэтилакрилата и изооктилакрилата и заканчивая форполимерами типа эпоксиакрилата бисфенола А и акрилатов сложных/простых полиэфиров (R.Golden. J.Coatings Technol., 69, 1997, с.83). Подобный (электронно-лучевой) способ закрепления печатных красок позволяет создать "функциональные печатные краски" с определенными химическими и физическими свойствами без использования растворителя и необходимых при работе с другими печатными красками систем закрепления, которые заметно усложняют весь технологический процесс изготовления предлагаемых в изобретении тест-элементов.

В основном, пригодные гидрофобные краски могут содержать мономеры, олигомеры и форполимеры с гидрофобными свойствами, например изооктилакрилаты, додецилакрилаты, производные стирола или кремния, соединения с частично фторированными углеродными цепями и дополнительные гидрофобные добавки и (или) наполнители, такие как придающие гидрофобные свойства реагенты, относящиеся к серии TEGO Phobe (компания TEGO Chemie Service, Эссен, Германия), гидрофобные пигменты, такие как фталоцианы меди, углерод, графит, или гидрофобные наполнители, такие как модифицированная кремнием коллоидальная двуокись кремния или порошки ПТФЭ и гранулы ПТФЭ. Благодаря широкому разнообразию добавок, пигментов и наполнителей предложенные выше соединения даны только для примера.

Печатные краски с гидрофильными свойствами могут быть получены путем выбора растворимых в этаноле и воде полимеров и смесей этих полимеров. Можно использовать полимеры и производные полимеров, сополимеры и соединения на основе альгината, целлюлозы и сложного эфира целлюлозы, гидроксиэтил целлюлозы, смол, акриловой кислоты, поливинилового спирта, полиэтиленгликоля, оксида полиэтилена, винилпиролидона, полистирол сульфоната, поли(метилвинилового эфира/малеиновой кислоты), сополимеров винилпиролидона/триметиламмония и производных алкил-фосфохолина. Возможна дополнительная оптимизация за счет использования добавок органомодифицированных силиконакрилатов, которые являются сшиваемыми разновидностями органомодифицированных полисилоксанов, и фторированных поверхностно-активных веществ. Общее пригодное покрытие обычно обеспечивает угол смачивания с водой менее 35° и поверхностную энергию более 50 мН/м.

Второй этап производства включает нанесение коагуляционных составов, содержащих вызывающий коагуляцию реагент и дополнительные реагенты для получения печатных и(или) дозируемых красок, образующих однородный слой в пределах чувствительных к пробе участков.

В предпочтительном варианте осуществления количество тромбопластина на первой поверхности 2а нижнего слоя 2 точно дозировано с использованием соответствующего метода, такого как струйная печать. Действительно, для специалистов очевидно, что можно использовать другие способы дозирования для целей настоящего изобретения.

На всех соответствующих чувствительных к пробе участках противоположная поверхность должна быть обработана требуемым количеством контрольного состава, содержащего нужное количество альгината или другого ускорителя коагуляции, этилендиаминотетрауксусную кислоту или другие ингибиторы коагуляции и флуоресцентный молекулярный ротор в качестве вспомогательного реагента регистрации, если это необходимо для выбранного режима регистрации.

Поскольку уровень концентрации, соответствующий общему количеству вызывающего коагуляцию реагента, нанесенного на заранее определенные чувствительные к пробе участки с 6"а1 по 6"а3, ответственен за чувствительность и динамический диапазон различных описываемых тест-элементов коагуляции, а также уровень концентрации и точность нанесенного количества соединений контроля ответственны за точность результатов теста, для этого применения важно обеспечить тест-элементы коагуляции с точной дозировкой вышеуказанных элементов, соединений и компонентов. Достичь точной дозировки можно, например, за счет использования системы микродозирующего устройства (например, предлагаемого компанией Vermes Technik GmbH & Со. KG, Palnkamer Str. 18-20, D-83624 Otterfing, Германия). Состав покрытия должен быть легко растворимым в жидкой среде пробы, чтобы обеспечить быстрое восстановление без остатков после введения жидкости пробы.

Следующий этап включает процедуру ламинирования, при которой нижний и верхний слои, представляющие собой первую и вторую поверхности системы распределения пробы, наложены слоями на центральный слой, определяя, тем самым, расстояние между первой и второй поверхностями нижнего и верхнего слоев. Центральный слой обеспечивает вырез для создания полости для системы распределения пробы на участках, где система распределения пробы образована на первой и второй поверхности нижнего и верхнего слоев. Структуры с высокой и низкой поверхностной энергией, образованные на первой и второй поверхности нижнего и верхнего слоев, должны быть выровнены практически конгруэнтно, чтобы обеспечивать образование функциональной системы распределения пробы между первой и второй поверхностями.

Точная xy-установка (фиксация) нижнего и верхнего слоев становится критичной для функционирования элемента, если это не достигается, система распределения пробы не будет функционировать правильно и(или) обладать большим отклонением по отношению к указанному объему пробы. Допустимые пределы отклонения должны составлять +/- 5% ширины гидрофильных каналов для достижения надежных характеристик.

На фиг.13 показан вид сверху (слева) и вид в поперечном сечении (справа) тест-элемента коагуляции и влияния качества установки. В случае 13а система распределения пробы собрана правильно с надежным совмещением гидрофильных каналов первой 2а и второй поверхностей 4а. Результат неправильно совмещенного тест-элемента коагуляции показан на фиг.13б. Хотя проставка между нижним 2 и верхним слоем 4 одинакова в случае 13а и 13б, объем пробы ошибочно увеличен в случае b, поскольку жидкость пробы частично покрывает гидрофобные направляющие элементы системы распределения пробы. Это вызвано жидкостью пробы внутри тест-элемента коагуляции, которая стремится обладать минимальной площадью поверхности, граничащей с атмосферой, чтобы достичь наиболее предпочтительного энергетического состояния и, следовательно, преодолеть влияние гидрофобных участков.

В альтернативном варианте осуществления, как показано на фиг.13в, система распределения пробы верхнего слоя 4 выполнена примерно на 10% меньше, чем система распределения пробы нижнего слоя 2, таким образом, общий объем пробы тест-элемента коагуляции определен выступами системы распределения пробы нижнего слоя, обеспечивающим большие допустимые пределы для смещения во время изготовления без ущерба для точности требуемого объема пробы.

Нанесение центрального слоя, который может быть двухсторонней клейкой лентой предпочтительно толщиной 80 микрон или, в альтернативном варианте, клеем-адгезивом, нанесенным с одинаковой толщиной, упрощено за счет относительно большого выреза в материале по сравнению с размером гидрофильных каналов. Правильная фиксация особенно важна на линиях непрерывного производства, где подложка поступает с несколькими измерительными устройствами до десятков измерительных устройств в минуту. Выступы подложки и натяжение полотна затрудняют установку в x-направлении (направление перемещения полотна) по сравнению с y-направлением, перпендикулярным перемещению полотна.

Способ изготовления гибких полимерных пленок, обеспечивающий точную фиксацию структур первой и второй поверхности, показан на фиг.14, где указаны этапы непрерывного производства полотна. На первом этапе производства по фиг.14а структуры системы 6 распределения пробы нижнего и верхнего слоя нанесены печатью на одну подложку 49 полотна, которая представляет собой материал создаваемых тест-элементов коагуляции. Как показано на фиг.14, напечатанные структуры системы 6 распределения пробы расположены на полотне подложек 49 таким образом, что две системы распределения пробы находятся друг напротив друга слева и справа от зеркальной линии. Необязательно, система распределения пробы присоединена на участках, которые образуют участки нанесения пробы. Таким образом, положение заранее определенных чувствительных участков 6а, 6"а фиксировано друг относительно друга и не зависит от выступов материала и натяжения полотна.

Штриховые линии 50 указывают линии будущего разреза для разделения тест-элементов коагуляции на полоски, в то время как штриховые линии 51 указывают зеркальную линию заготовки полоски и будущую линию сгиба подложки полотна.

После печати траекторий потока тест-элемента коагуляции чувствительные участки 6а, 6"а системы распределения пробы покрывают требуемым составом. Например, чувствительные участки 6а верхнего ряда подложки 49 полотна, которые представляют собой вторую поверхность тест-элемента коагуляции, покрывают составом для контроля качества. Один из составов контроля качества (например, расположенный на участке 6"а1) не содержит активных соединений, которые либо ингибируют, либо ускоряют реакцию коагуляции и, следовательно, обеспечивают определенный результат анализа коагуляции, в то время как чувствительные участки 6"а нижнего ряда подложки 49 полотна, который представляет собой первую поверхность тест-элемента коагуляции, покрыты коагуляционными составами, содержащими тканевой тромбопластин для инициации реакции коагуляции. В особых случаях другие соединения помимо тканевого тромбопластина наносят в виде покрытия на чувствительные к пробе участки 6"а, которые запускают и активируют канал коагуляции в различных положениях для определения функциональных возможностей других факторов коагуляции.

После этого дополнительный слой накладывается на одну из поверхностей, например поверхность 2а нижнего слоя 2, представляющую собой центральный слой 52 тест-элемента коагуляции, как показано на фиг.14б. Центральный слой 52 может быть изготовлен из двухсторонней клейкой ленты или клея-адгезива, который обеспечивает прорывы 5, раскрывающие систему 6 распределения пробы для создания полостей для систем распределения пробы в тест-элементах коагуляции после заключительного этапа сборки.

Тест-элемент коагуляции по настоящему изобретению затем собирают посредством сгибания двух боковых сторон вдоль зеркальной линии 51, например, с помощью отгибающего аппарата или другого соответствующего оборудования, как показано на фиг.14в, создающего согнутое и ламинированное полотно 53, как показано на фиг.14г. Следовательно, можно прижимным валиком плотно соединить центральный слой, нижний и верхний слои.

Наконец, ламинированное полотно 53 вырезают или высекают в изделие нужной формы, тогда как линия 50 переносит примерную форму окончательной тест-полоски коагуляции на полотно 53 перед разделением. При способе изготовления, показанном на фиг.14, верхняя часть подложки может быть отогнута на нижнюю часть без риска ухудшения фиксации в x-направлении полотна и обеспечивает более простой способ добиться правильной установки первой и второй поверхностей, образующих систему распределения пробы, по сравнению со способом с одним слоем.

Для специалистов в данной области будет очевидно, что нижний и верхний слои являются взаимозаменяемыми в описанных вариантах осуществления, что не влияет на принцип настоящего изобретения.

Настоящее изобретение обеспечивает тест-систему для определения характеристик коагуляции проб плазмы и цельной крови, состоящую из тест-элемента коагуляции и небольшого простого переносного измерительного устройства, пригодного для установки дома и в лечебном учреждении. Тест-элемент коагуляции снабжен встроенной системой контроля качества для формата тест-полоски с сухими реагентами с очень малым объемом пробы, примерно 0,5 мкл. Изготовление тест-элемента коагуляции по настоящему изобретению не требует выполнения множества технологически сложных операций и позволяет изготавливать недорогие тест-элементы.

1. Тест-элемент для определения коагуляции в пробе плазмы или цельной крови, имеющий первую (2а) и вторую (4а) поверхности, расположенные на заданном расстоянии напротив друг друга и обе содержащие две по существу одинаковые структуры, образующие участки с высокой и низкой поверхностной энергией, выровненные в основном конгруэнтно относительно друг друга, так что участки с высокой поверхностной энергией образуют систему (6) распределения пробы с, по меньшей мере, двумя чувствительными к коагуляции участками (6а1, 6а2), причем, по меньшей мере, один чувствительный участок (6а, 6"а) на первой и второй поверхностях (2а, 4а) снабжен, по меньшей мере, одним вызывающим коагуляцию реагентом.

2. Тест-элемент по п.1, в котором, по меньшей мере, один чувствительный к коагуляции участок снабжен составом, содержащим ускоритель коагуляции, который способствует быстрой и полной коагуляции жидкости пробы.

3. Тест-элемент по п.1, в котором, по меньшей мере, один чувствительный к коагуляции участок снабжен составом, содержащим ингибитор коагуляции, который подавляет коагуляцию в жидкости пробы.

4. Тест-элемент по п.1, в котором система (6) распределения пробы содержит, по меньшей мере, три чувствительных к коагуляции участка, по меньшей мере, один из которых снабжен составом, ускоряющим коагуляцию жидкости пробы, и, по меньшей мере, один снабжен составом, подавляющим коагуляцию в жидкости пробы.

5. Тест-элемент по одному из предшествующих пунктов, в котором вызывающим коагуляцию реагентом(ами) являются тромбопластин и(или) ионы кальция.

6. Тест-элемент по п.2, в котором состав, ускоряющий коагуляцию жидкости пробы, содержит гелеобразующее средство.

7. Тест-элемент по одному из пп.1, 4 или 6, в котором состав, подавляющий коагуляцию в жидкости пробы, содержит гепарин лития и (или) этилендиаминотетрауксусную кислоту.

8. Тест-элемент по одному из пп.1-4 или 6, в котором первая и(или) вторая поверхности (2а, 4а) чувствительного участка(ов) (6а, 6"а) снабжены соединением, позволяющим определить реакцию коагуляции по фотометрии пропускания или поглощения.

9. Тест-элемент по одному из пп.1-4 или 6, в котором первая и(или) вторая поверхности (2а, 4а) чувствительного участка(ов) (6а, 6"а) снабжены(а) соединением(ями), позволяющими определить реакцию коагуляции посредством флуоресценции.

10. Тест-элемент по п.9, в котором соединение(я), позволяющее(ие) определить реакцию коагуляции посредством флуоресценции, является флуоресцентным молекулярным ротором.

11. Способ изготовления тест-элемента коагуляции, включающий следующие шаги:
формирование участков с высокой и низкой поверхностной энергией на нижнем слое (2) с первой поверхностью (2а), причем участки с высокой поверхностной энергией образуют гидрофильную систему (6) распределения пробы с, по меньшей мере, двумя заранее определенными чувствительными участками (6а1, 6а2),
формирование соответствующей структуры участков с высокой и низкой поверхностной энергией на верхнем слое (4) со второй поверхностью (4а), покрытие, по меньшей мере, одного заранее определенного чувствительного участка(ов) (6а, 6"а) первой поверхности (2а) и(или) второй поверхности (4а), по меньшей мере, одним вызывающим коагуляцию реагентом,
наложение слоев первой и второй поверхностей на противоположные участки центрального слоя (3) с вырезом (5), обеспечивающим полость для системы (6) распределения пробы, образованную участками с высокой поверхностной энергий на первой и второй поверхностях (2а, 4а) первого и второго слоев (2, 4).

12. Способ по п.11, включающий следующие дополнительные шаги:
покрытие первой и(или) второй поверхностей (2а, 4а) дополнительного чувствительного к коагуляции участка (6а2) составом, содержащим ускоритель коагуляции, способствующий быстрой и полной коагуляции жидкости пробы,
покрытие первой и(или) второй поверхности (2а, 4а) другого чувствительного к коагуляции участка (6а3) составом, содержащим ингибитор коагуляции, подавляющим коагуляцию в жидкости пробы.

13. Способ по п.11 или 12, включающий дополнительный шаг покрытия первой и(или) второй поверхностей (2а, 4а) чувствительного к коагуляции участка(ов) соединением, позволяющим определить реакцию коагуляции посредством флуоресценции.

14. Способ по п.11 или 12, в котором указанные участки с высокой поверхностной энергией создают посредством нанесения нерастворимого в воде гидрофильного состава на первую и вторую поверхности (2а, 4а).

15. Способ по п.11 или 12, в котором указанные участки с низкой поверхностной энергией создают посредством нанесения гидрофобных составов на первую и вторую поверхности (2а, 4а).

16. Способ по п.14, в котором указанные гидрофильный и(или) гидрофобный состав(ы) наносят печатью на первую и вторую поверхности (2а, 4а) посредством флексографии, литографии, глубокой печати, переноса твердого красителя или струйной печати.

17. Способ по п.15, в котором указанные гидрофильный и(или) гидрофобный состав(ы) наносят печатью на первую и вторую поверхности (2а, 4а) посредством флексографии, литографии, глубокой печати, переноса твердого красителя или струйной печати.

18. Способ по п.11 или 12, в котором на чувствительные участки (6а, 6"а) первой и(или) второй поверхностей (2а, 4а) посредством микроконтактной печати или напыления микрочастиц наносят покрытие указанного вызывающего коагуляцию реагента(ов) и(или) контрольного состава(ов), и(или) вспомогательной добавки(ок) для регистрации флуоресценции.

19. Способ по п.13, в котором на чувствительные участки (6а, 6"а) первой и(или) второй поверхностей (2а, 4а) посредством микроконтактной печати или напыления микрочастиц наносят покрытие указанного вызывающего коагуляцию реагента(ов) и(или) контрольного состава(ов), и(или) вспомогательной добавки(ок) для регистрации флуоресценции.

20. Способ по п.14, в котором на чувствительные участки (6а, 6"а) первой и(или) второй поверхностей (2а, 4а) посредством микроконтактной печати или напыления микрочастиц наносят покрытие указанного вызывающего коагуляцию реагента(ов) и(или) контрольного состава(ов), и(или) вспомогательной добавки(ок) для регистрации флуоресценции.

21. Способ по п.15, в котором на чувствительные участки (6а, 6"а) первой и(или) второй поверхностей (2а, 4а) посредством микроконтактной печати или напыления микрочастиц наносят покрытие указанного вызывающего коагуляцию реагента(ов) и(или) контрольного состава(ов), и(или) вспомогательной добавки(ок) для регистрации флуоресценции.

22. Тест-система коагуляции для определения коагуляции в пробе плазмы или цельной крови, содержащая
тест-элемент коагуляции по одному из пп.1-10,
устройство регистрации для регистрации изменений поглощения света или флуоресценции в сыворотке или жидкости пробы цельной крови, расположенное на заранее определенном чувствительном участке(ах), обрабатывающее устройство для обработки данных от указанного устройства регистрации и расчета времени коагуляции и(или) значения международного нормализованного отношения (MHO), и
устройство отображения для индикации выходных значений пользователю.

23. Способ определения коагуляции в сыворотке или жидкости пробы цельной крови, в котором:
наносят сыворотку или жидкость пробы цельной крови на тест-элемент коагуляции по одному из пп.1-10,
вводят тест-элемент коагуляции в измерительное устройство, содержащее устройства регистрации и обработки,
считывают выходные значения с устройства отображения.

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике, точнее к биохимическим методам исследования крови. .

Тест-система коагуляции

КОАГУЛЯЦИОННЫЙ ГЕМОСТАЗ

Вторичный, или коагуляционный, гемостаз обеспечивает плотную закупорку поврежденных сосудов красным тромбом , состоящим из сети волокон фибрина с захваченными ею клетками крови (тромбоцитами, эритроцитами и др.).

Упрощенная схема свертывания крови:
1)под влиянием «активатора протромбина» - тромбокиназы, образующейся при повреждении тканей, агрегации и разрушении тромбоцитов, и в результате сложных химических взаимодействий факторов свертывания крови, белок плазмы протромбин превращается в тромбин
2)тромбин в свою очередь, расщепляет растворенный в плазме фибриноген с образованием фибрина, волокна фибрина образуют основу тромба
Через несколько часов они активно сжимаются - происходит ретракция сгустка, в результате которой из него выдавливается светлая жидкость - сыворотка.

Свертывание крови в целом представляет собой многоступенчатый каскадный процесс , протекающий с участием многочисленных факторов свертывания. Все факторы присутствуют в плазме в неактивной форме. Они обозначаются римскими цифрами и соответствующими названиями, в которых отражена их функция. Для обозначения активированных факторов свертывания добавляется буква «а».

Следует помнить также , что фактор VI изъят из классификации, так как представляет собой активированный фактор V. Некоторые из факторов свертывания не имеют цифровых обозначений.

Процесс свертывания крови принято условно разделять на две основные фазы:
Фаза активации - многоступенчатый этап свертывания, завершающийся активизацией протромбина (фактор II) с превращением его в активный фермент тромбин (фактор IIа).
Фаза коагуляции - конечный этап свертывания, в результате которого под влиянием тромбина фибриноген (фактор I) превращается в фибрин.

Фаза активации

Центральным звеном сложных химических превращений этой фазы является образование так называемого «активатора протромбина», который представляет собой ферментный комплекс, состоящий из активированных факторов свертывания Ха, Va, ионов Са2+ и фосфолипопротеидов.

Источником последних могут быть:
фосфолипопротеиды , высвобождающиеся при повреждении тканей, в частности, эндотелия сосудов или соединительной ткани (тканевой тромбопластин - фактор III)
фосфолипопротеиды мембран тромбоцитов, выходящие в плазму при их разрушении (тромбоцитарный фактор 3)

Таким образом, формирование ключевого ферментного комплекса этой фазы - «активатора протромбина» - происходит двумя путями, в соответствии с которыми различают две системы свертывания:
1.Внешняя система , которая активируется при повреждении тканей в течение нескольких секунд. Фосфолипопротеиды, выходящие из тканевых клеток (тканевой тромбопластин, или фактор III), в присутствии ионов Са2+ активируют фактор VII (проконвертин). Последний в комплексе с фосфолипопротеидами поврежденной ткани и ионами Са2+, в свою очередь, активирует фактор Х, входящий затем в состав “активатора протромбина”.
2.Внутренняя система , активация которой происходит несколько медленнее (в течение минут) и без участия тканевого тромбопластина. Пусковым фактором этого механизма является фактор XII (фактор Хагемана), который активируется двумя путями:
при контакте крови с коллагеном субэндотелия поврежденного сосуда или с любой чужеродной поверхностью (стеклом, металлом, каолином и т. д.)
при ферментативном расщеплении фактора Хагемана протеолитическими ферментами (калликреином, тромбином, трипсином и др.) с участием высокомолекулярного кининогена (ВМК)

Фактор ХIIа активирует фактор XI. Последний, в свою очередь, активирует фактор IX. Наконец, фактор IХа образует ферментный комплекс с фосфолипопротеидами, высвобождающимися при разрушении тромбоцитов (т. е. с тромбоцитарным фактором 3), который в присутствии ионов Са2+ и плазменного фактора VIIIа (фактора Виллебранда) активирует фактор X. Последний также входит в состав “активатора протромбина”. Образовавшийся двумя путями ключевой ферментный комплекс - “активатор протромбина” - протеолитически расщепляет неактивный предшественник протромбин (фактор II) (молекулярная масса 72 000), в результате чего образуется активный протеолитический фермент тромбин (молекулярная масса 35 000), представляющий собой пептидазу. Действие тромбина не ограничивается только протеолизом фибриногена на следующем этапе свертывания крови. Тромбин способствует также необратимой агрегации тромбоцитов, а также активирует ряд факторов свертывания (V, VIII, XIII). Следует помнить, что внешний и внутренний механизмы свертывания взаимосвязаны между собой: между отдельными их этапами существуют своеобразные «мостики» - альтернативные пути для процессов коагуляции. Так, комплекс факторов ХIIа–калликреин–кининоген (внутренний механизм) ускоряет активацию фактора VII (внешний механизм), а фактор VIIa ускоряют активацию фактора IX (внутренний механизм).

Фаза коагуляции

В течение этой фазы происходит образование фибрина из его предшественника фибриногена.

Процесс протекает в два этап:
на первом этапе - фибриноген расщепляется тромбином на четыре растворимых мономера фибрина (по два пептида А и В), у каждого из которых имеются по 4 свободные связи
на втором этапе - мономеры соединяются друг с другом, формируя полимеры, из которых строятся волокна фибрина

Процесс необратимой полимеризации фибрина происходит с участием фибриностабилизирующего фактора XIII в присутствии ионов Са2+.

Однако на этой стадии трехмерная сеть волокон фибрина, которая содержит эритроциты, тромбоциты и другие клетки крови, все еще относительно рыхлая. Свою окончательную форму она принимает после ретракции сгустка, возникающей при активном сокращении волокон фибрина и выдавливании сыворотки. Благодаря ретракции сгусток становится более плотным и стягивает края раны.

!!! Следует упомянуть еще об одном возможном пути превращения фибриногена в фибрин на конечной стадии свертывания крови - о так называемом феномене паракоагуляции, который наблюдается, например, при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдроме).

В отличие от обычного (описанного выше) процесса полимеризации волокон фибрина из его мономеров, при этом синдроме значительно снижается чувствительность к тромбину и нарушается процесс полимеризации фибрин-мономеров. Это происходит в результате того, что часть фибрин-мономеров образуют с фибриногеном и продуктами его распада комплексные крупно- и среднемолекулярные соединения - растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК). Они плохо реагируют на действие тромбина, обладая относительной тромбинрезистентностью, но образуют гель при добавлении к плазме этанола, протаминсульфата или бета-нафтола. Это и есть феномен неферментативного свертывания, или феномен паракоагуляции. Выявление РФМК имеет важное значение для диагностики ДВС-синдрома.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ свертывающей системы крови

Для определения состояния гемокоагуляции используют несколько групп методов:
ориентировочные (базисные) методы, характеризующие процесс свертывания в целом, отдельные его фазы, а также дающие возможность оценить внешний и внутренний механизмы коагуляции
методы, позволяющие дифференцировать дефицит отдельных факторов свертывания крови
методы, позволяющие выявить внутрисосудистую активацию системы свертывания крови

К базисным методам относятся:
1.определение времени свертывания крови
2.определение времени рекальцификации стабилизированной крови (плазмы)
3.протромбиновое время (протромбиновый индекс)
4.тромбиновое время

1. Время свертывания крови

1.1 Определение времени свертывания цельной нестабилизированной крови проводится непосредственно у постели больного.

Иглой без шприца пунктируют локтевую вену. Первые капли крови выпускают на ватный тампон и набирают по 1 мл крови в 2 сухие пробирки. Включив секундомер, ставят пробирки в водяную баню при температуре 37°С. Через 2–3 мин, а затем каждые 30 с пробирки слегка наклоняют, определяя момент, когда кровь свернется. Определив время образования сгустка крови в каждой из пробирок, вычисляют средний результат.

В норме время свертывания составляет 5–10 мин.

!!! Удлинение времени свертывания свидетельствует о значительных сдвигах в системе гемокоагуляции и чаще указывает на:
выраженную недостаточность факторов, участвующих во внутреннем механизме коагуляции
дефицит протромбина
дефицит фибриногена
наличие в крови ингибиторов свертывания, в частности гепарина

1.2 Метод Моравица
В клинике до сих пор используется еще один упрощенный метод определения времени свертывания крови. Он применяется, в основном, для динамического контроля за состоянием гемокоагуляции при лечении прямыми антикоагулянтами.

На предметное стекло наносят каплю крови, взятую из пальца или мочки уха. Включив секундомер, каждые 20–30 с в каплю крови опускают тонкий стеклянный капилляр. Время свертывания определяют в момент появления первой тонкой нити фибрина при вытягивании капилляра из капли крови.

В норме свертывание крови составляет около 5 мин.

2. Активированное время рекальцификации плазмы

Метод основан на измерении времени свертывания тромбоцитарной плазмы при добавлении в нее оптимального количества кальция хлорида или каолина, что обеспечивает стандартизацию контактной активизации факторов свертывания.

В пробирку с раствором кальция хлорида или каолина, установленную в водяной бане при температуре 37°С, добавляют 0,1 мл плазмы и по секундомеру определяют время образования сгустка.

В норме время рекальцификации плазмы с кальция хлоридом составляет 60–120 с, с каолином - 50–70 с.

Изменения этого показателя неспецифичны и указывают лишь на общую тенденцию к гиперкоагуляции (укорочение времени рекальцификации) или к гипокоагуляции (увеличение показателя).

Удлинение времени рекальцификации может быть обусловлено:
Недостаточностью большинства плазменных факторов свертывания (кроме факторов VII и XIII).
Дефицитом тромбоцитарного фактора III (при выраженной тромбоцитопении или нарушении реакции высвобождения).
Избыточным содержанием в плазме ингибиторов свертывания (гепарина)
Наличием ДВС-синдрома.

3. Активированное частичное (парциальное) тромбопластиновое время (АЧТВ)

Принцип метода заключается в определении времени свертывания плазмы в условиях стандартизации не только контактной, но и фосфолипидной (тромбопластиновой) активации факторов свертывания. С этой целью к плазме добавляют смесь каолина и кефалина (тромбопластиновый активатор), а также кальция хлорид и по секундомеру определяют время свертывания плазмы.

В норме АЧТВ (кефалин-каолиновое время) составляет 35–50 с.

Уменьшение АЧТВ свидетельствует о гиперкоагуляции и склонности к тромбозам, увеличение - о гипокоагуляции крови.

!!! АЧТВ чрезвычайно чувствительно к дефициту плазменных факторов свертывания, участвующих во внутреннем механизме свертывания (факторы XII, XI, IX, VIII) и не зависит от дефицита тромбоцитов или их функциональной недостаточности (в связи с добавлением кефалина).

АЧТВ удлиняется также при наличии в крови ингибиторов свертывания (гепарина) и может быть использован как чувствительный тест для контроля за лечением гепарином.

4. Протромбиновое время (ПВ, протромбиновый индекс)

Метод представляет собой еще одну модификацию определения времени рекальцификации плазмы при добавлении в нее тканевого тромбопластина человека или кролика, что приводит к «запуску» свертывания по внешнему механизму. Тканевой тромбопластин в комплексе с фактором VII и ионом Са2+ активирует фактор X, входящий в состав «проактиватора протромбина».

В пробирку с 0,1 мл плазмы и 0,1 мл раствора тромбопластина, установленную в водяной бане при температуре 37°С, добавляют 0,1 мл раствора кальция хлорида и по секундомеру определяют время образования сгустка.

В норме протромбиновое время составляет 12–18 с и во многом зависит от активности тканевого тромбопластина, использованного при исследовании. Поэтому в большинстве случаев для определения этого показателя одновременно по той же методике исследуют плазму донора и вычисляют так называемый протромбиновый индекс (ПИ) :

ПИ=(ПBд/ ПВб)*100%

Где ПИ - протромбиновый индекс, ПBд и ПВб - протромбиновое время донора и больного, соответственно. В норме протромбиновый индекс составляет 90-100%. Чем больше протромбиновое время, свидетельствующее о гипокоагуляции крови, тем меньше значения протромбинового индекса.

Удлинение протромбинового времени (уменьшение протромбинового индекса) интегрально отражает недостаточность плазменных факторов, участвующих во внешнем механизме свертывания и в активации протромбина (VII, X, V), а также на конечных этапах коагуляции (I и II).

Наиболее частыми причинами такого изменения являются:
Прием непрямых антикоагулянтов (фенилин, синкумор, неодикумарин и др.).
Дефицит соответствующих витамин К-зависимых факторов свертывания (факторы II, VII, IХ, X) при тяжелых поражениях паренхимы печени (гепатит, цирроз, рак) и недостаточности витамина К (механическая желтуха, нарушения всасывания в кишечнике, дисбактериоз кишечника и т. п.).
Дефицит фибриногена (гипофибриногенемия), являющегося К-независимым фактором свертывания (тяжелые поражения паренхимы печени и др.).
Наличие феномена паракоагуляции, в частности, при ДВС-синдроме.

МНО (Международное нормализованное отношение, INR) - показатель системы свертывания крови.

Основные показания к применению: лечение антикоагулянтами непрямого действия – варфарином, аценокумаролом и другими аналогами.
МНО – показатель, рассчитывающийся при определении протромбинового времени.
Определение МНО гарантирует возможность сравнения результатов при определении ПВ, обеспечивая точный контроль терапии непрямыми антикоагулянтами.
Для диагностики нарушений свертывания крови используют показатель ПВ, выражающийся в секундах.
В тех случаях, когда определение ПВ применяют для оценки проведения лечения варфарином, используется показатель МНО - международное нормализованное отношение (INR - International Normalized Ratio).
Этот показатель позволяет выразить результаты ПВ с учетом использования в различных лабораториях коммерческих препаратов тромбопластина, используемого в определении ПВ.
Такой подход гарантирует возможность сравнения результатов полученных в разных лабораториях и проводить более точный контроль при лечении антикоагулянтами непрямого действия.
МНО вычисляется при делении ПВ пациента на значение нормального ПВ, далее результат возводится в степень, показатель которой равен международному индексу чувствительности (ISI или МИЧ - международный индекс чувствительности) тромбопластина:
МНО = (ПВ пациента/среднее нормальное ПВ)
Доза антикоагулянта подбирается так, что бы поддерживать МНО на необходимом уровне, в зависимости от заболевания.
Наиболее часто используемым антикоагулянтом непрямого действия в клинической практике является варфарин.
Применять анализ целесообразно с одновременным определением АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время).

Референтные значения МНО:
В каждом конкретном случае необходимо поддерживать МНО на определенном уровне. Дозы назначаемого препарата выбираются лечащим врачом.
В норме: МНО = 0,8 - 1,15.
При лечение венозного тромбоза: МНО = 2,0-3,0.
Лечение артериальной тромбоэмболии, рецидивирующей системной эмболии: МНО= 3,0 -4,0.
Профилактика пристеночных тромбозов при мерцательной аритмии: МНО=1,5-2.

Факторы искажающие результат:
Недостаточное наполнение пробирки кровью, недостаточное перемешивание крови с антикоагулянтом, а также несвоевременная отправка пробы в лабораторию.
Гемолиз вследствие травматичной пункции вены или небрежного обращения с пробой крови.

Увеличение показателя МНО:
Болезни печени.
Дефицит витамина К.
Внутрисосудистое свёртывание.
Наследственный дефицит факторов II (протромбин), V, VII, X.
Афибриногенемия.
Гипофибриногенемия (уровень фибриногена менее 50 мг/100 мл).
Дисфибриногенемия.
Лечение кумарином.
Циркулирующие антикоагулянты.
____________________________________________________________________________________________________________________________

5. Тромбиновое время

Метод оценки тромбинового времени заключается в определении времени свертывания плазмы при добавлении в нее тромбина со стандартной активностью, который обладает способностью индуцировать превращение фибриногена в фибрин без участия других факторов свертывания крови.

В пробирку с 0,2 мл плазмы, установленную в водяной бане при температуре 37°С, добавляют 0,2 мл стандартного раствора тромбина и по секундомеру определяют время образования сгустка. В норме тромбиновое время составляет 15–18 с.
Определение тромбинового времени позволяет оценить конечный этап свертывания крови (превращение фибриногена в фибрин). Тромбиновое время, таким образом, зависит от концентрации фибриногена, его свойств и наличия в крови ингибиторов тромбина (гепарин, антитромбин III).

Причинами удлинения тромбинового времени являются:
Афибриногенемия и гипофибриногенемия.
ДВС-синдром и другие патологические состояния, сопровождающиеся феноменом паракоагуляции с нарушением процесса полимеризации фибрина и нарастанием концентрации в крови продуктов деградации фибрина (ПДФ).
Тяжелые поражения белковосинтетичекой функции печени, сопровождающиеся снижением синтеза фибриногена.
Острый фибринолиз.
Увеличение в крови концентрации ингибиторов тромбина (антитромбина III, гепарина).

Определение тромбинового времени используется для контроля за лечением гепарином и фибринолитиками.

6. Аутокоагуляционный тест (АКТ)

Метод заключается в исследовании динамики образования и инактивации тромбина в разведенной в 20 раз и гемолизированной крови пациента при добавлении гипотонического раствора кальция хлорида. Оценивается свертывающая активность гемолизат-кальциевой смеси с помощью гемокоагулографа.
Гемолизированные эритроциты обеспечивают контактную и фосфолипидную активацию процесса свертывания (подобно каолину и кефалину при исследовании активированного частичного тромбопластинового времени). Таким образом, аутокоагуляционный тест оказывается чувствительным к нарушениям внутреннего механизма свертывания.

Показатель
А - Свертывающая активность на 2-й мин инкубации, %
Нормальные величины = 15,5 ± 3,0
Показатель
МА - Максимальная свертывающая активность, %
Нормальные величины = 100 ± 1,1
Показатель
T1 - Время достижения 1/2 максимальной активности, мин
Нормальные величины = 3,7 ± 0,2
Показатель
Т2 - Время достижения максимальной активности, мин
Нормальные величины = 9,5
Показатель
Т - Время от начала инкубации до момен-та, когда активность снижается до 1/2 МА
Нормальные величины = 35

Увеличение значений T1 и Т2, а также уменьшение А и МА свидетельствуют о гипокоагуляции, которая может быть обусловлена:
дефицитом факторов внутреннего механизма свертывания (XII, XI, IX, VIII)
дефицитом факторов X и V (“проактиватора протромбина”)
дефицитом факторов конечного этапа коагуляции (I и II)
избытком ингибиторов тромбина (гепарин, антитромбин III и др.)

7. Тромбоэластография

Широкое распространение в клинической практике получил метод тромбоэластографии, который позволяет регистрировать свертывание крови и изменения упругости сгустка крови во времени (ретракцию и лизис).

Основной частью любого типа тромбоэластографа (гемокоагулографа) является кювета, в которую вносят исследуемую кровь. В кювету погружают стержень с диском или пластиной на конце, которая не касается ее стенок. Стержень связан с регистрирующим устройством тромбоэластографа. Специальное устройство придает кювете колебательно-вращательные движения, которые могут передаваться на стержень (и регистрирующее устройство), только когда в кювете, заполненной кровью, начнется образование нитей фибрина. По мере образования и уплотнения сгустка амплитуда колебаний стержня увеличивается и достигает максимума.

Предложено множество количественных показателей тромбоэластограммы, три из которых заслуживают внимания:
1.Время реакции (R) - время от начала исследования до начала свертывания крови (первых отклонений тромбоэластограммы от прямой линии).
2.Время коагуляции (К) - время от начала движений стержня прибора до момента, когда амплитуда тромбоэластограммы составит 20 мм.
3.Максимальная амплитуда (МА) тромбоэластограммы .

Считается, что время R характеризует в основном первую фазу коагуляции, а время К - интенсивность образования фибрина. Нормальные величины приведенных трех показателей тромбоэластограммы обычно устанавливают эмпирически для каждого прибора. В среднем у здоровых людей время реакции (R) составляет 4-10 мин, время коагуляции (К) - 5-7 мин, а максимальная амплитуда (МА) - 45-65 мин.

!!! Для гиперкоагуляции крови характерно укорочение R, К и увеличение МА, а для гипокоагуляции - удлинение R и К и уменьшение МА.

Следует отметить , что в целом чувствительность тромбоэластографии к нарушениям гемокоагуляции достаточно низкая, сопоставимая с чувствительностью времени свертывания крови, а тромбоэластографические показатели лишь весьма приблизительно отражают отдельные стадии процесса коагуляции. Тем не менее, тромбоэластография может использоваться в клинике для динамического контроля за лечением антикоагулянтами.

____________________________________________________________________________________________________________________________

Принципы оценки базисных методов диагностики нарушений коагуляционного гемостаза
Оценка свертывания крови с помощью описанных базисных тестов позволяет составить общее ориентировочное представление о процессе коагуляции крови. При этом следует иметь в виду, что такие показатели как время свертывания крови и время рекальцификации плазмы обладают весьма низкой чувствительностью и специфичностью, и, следовательно, информативностью: они изменяются, как правило, лишь при выраженных нарушениях коагуляции крови и не позволяют судить (хотя бы предположительно) о повреждениях отдельных ее механизмов и этапов.
Преимуществом в этом отношении обладают три базисных теста:
1.тромбиновый
2.протромбиновый
3.АЧТВ или АКТ (их изменения сходны)

Они позволяют судить не только о состоянии всей свертывающей системы в целом, но и о возможной недостаточности отдельных факторов свертывания.
При дефиците фактора VII (проконвертина), участвующего только во внешнем механизме свертывания, удлиняется только протромбиновое время, а тромбиновый тест и АЧТВ остаются без изменения.
При дефиците факторов XII, XI, IX, VIII и прекалликреина, участвующих только во внутреннем механизме коагуляции, изменяются АЧТВ (и АКТ), а протромбиновое и тромбиновое время свертывания остаются нормальными.
При дефиците факторов X, V, II, на которых замыкаются оба механизма свертывания, нарушения обнаруживаются как в протромбиновом тесте, так и в АЧТВ. Тромбиновое время при этом не изменяется.
Наконец, при нарушениях количества, структуры и свойств фибриногена (фактор I) изменения выявляются при выполнении всех трех базисных тестов. При этом целесообразно также оценить уровень фибриногена в сыворотке крови (см. ниже).
При дефиците фактора XIII показания всех трех базисных тестов оказываются нормальными.

Дальнейшее уточнение механизмов нарушения коагуляции крови производят с помощью дифференцирующих тестов, подробно описанных в специальных руководствах.

____________________________________________________________________________________________________________________________

8. Определение фибриногена

Наибольшее распространение в клинической практике получили два метода определения фибриногена:
1.Гравиметрический метод заключается в высушивании и взвешивании сгустка, который образуется при добавлении в плазму 0,2 мл стандартного раствора тромбина.
2.Колориметрический метод также основан на превращении фибриногена в фибрин путем добавления в плазму раствора тромбина. Фибриновый сгусток подвергают гидролизу, а в гидролизат добавляют биуретовый реактив (см. выше) и колориметрируют, определяя концентрацию белка.

Оба метода дают близкие результаты . Содержание фибриногена в плазме здорового человека составляет 2–4 г/л.

Уменьшение концентрации фибриногена наблюдается:
при врожденной недостаточности фибриногена (афибриногенемия, гипофибриногенемия, некоторые варианты дисфибриногенемии)
при тяжелых заболеваниях паренхимы печени (цирроз, рак, гепатит)
при ДВС-синдроме
при остром фибринолизе

Нередко встречается увеличение концентрации фибриногена. Наиболее частыми причинами гиперфибриногенемии являются:
острые инфекционные заболевания
острые и хронические воспалительные заболевания
злокачественные новообразования
тромбозы и тромбоэмболии, в том числе у больных острым инфарктом миокарда, ишемическим инсультом и т. п.

9. Определение высокомолекулярных производных фибриногена

Наиболее важными в практическом отношении высокомолекулярными производными фибриногена являются:
1) Растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК) - представляет собой высокомолекулярные растворимые комплексы фибрин-мономера с фибриногеном и с продуктами расщепления фибриногена/фибрина. В норме РФМК не обнаруживаются. Появление РФМК в плазме свидетельствует о нарушении процесса нормальной полимеризации фибрин-мономеров. РФМК плохо коагулируют под влиянием тромбина, обладая относительной тромбинрезистентностью
2) Продукты деградации фибриногена (ПДФ) - в небольших количествах образуются и в норме в результате расщепления фибрина, присутствующего в плазме и в отложениях, под влиянием плазмина (см. ниже). Повышение содержания ПДВ - признак усиливающегося внутрисосудистого свертывания крови или массивных тромбоэмболий, сопровождающихся активацией фибринолитической системы.

Определение растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК). Для выявления РФМК в клинике чаще используются так называемые паракоагуляционные тесты. Они основаны на феномене неферментативного свертывания РФМК: при добавлении к плазме, в которой содержатся РФМК, 50% раствора этанола или 1% раствора протамина сульфата из растворимых комплексов фибрин-мономера с продуктами расщепления фибриногена/фибрина и фибриногеном высвобождаются фибрин-мономеры, которые затем полимеризуются с образованием геля. Проба с 50% раствором этанола является более чувствительной. В пробирку набирают 0,15 мл 50% этанола и 0,5 мл плазмы. Пробирку встряхивают и помещают в штатив при комнатной температуре. Проба расценивается как положительная, если через 1–10 мин в пробирке образуется гель. Помутнение или появление небольшой зернистости является признаком отрицательной пробы (нормальный показатель). Проба с протамина сульфатом позволяет выявить не только полимеризацию фибрин-мономеров, высвобождающихся из РФМК, но и обнаружить осаждение ранних продуктов расщепления фибриногена/фибрина.

Перед началом исследования предварительно готовят 5 разведений 1% раствора протамина сульфата (в 5, 10, 20, 40 и 80 раз). В каждое из приготовленных разведений добавляют 0,2 мл плазмы. Пробирки оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Оценка результатов проводится так же, как и в пробе с этанолом. В норме отрицательный результат обнаруживают во всех разведениях протамина сульфата. Если хотя бы в одном из разведений образуется гель, результат оценивается как положительный.

Положительная проба с этанолом, а также положительный результат протаминсульфатной пробы в первых 1–2 разведениях свидетельствует о наличии в плазме РФМК. Образование геля во всех разведениях протамина сульфата больше характерно для повышения уровня ранних продуктов расщепления фибриногена/фибрина.

!!! Положительные результаты обеих проб встречаются при ДВС-синдроме или массивных тромбозах и тромбоэмболиях, сопровождающихся активацией системы фибринолиза.

Определение продуктов деградации фибрина (ПДФ). Для определения ПДФ в крови используют различные иммунологические и неиммунологические методы. Наиболее простым из них является проба с протамина сульфатом. В пробирку набирают 0,4 мл свежей сыворотки крови и добавляют 0,1 мл 1% раствора протамина сульфата. Помутнение или мелкую зернистость оценивают как отрицательный результат (норма), а образование геля, хлопьев или нитей фибрина - как положительный, свидетельствующий о повышении содержания ПДФ в сыворотке крови больше 0,015 г/л.
В основе иммунодиффузного метода определения ПДФ лежит образование дуг преципитации на агаровой пластине, на которую наносят на определенном расстоянии друг от друга исследуемую и антифибриногеновую сыворотки. Обычно используют стандартную антисыворотку, которую помещают в центральные лунки на агаровой пластинке. В периферические лунки вносят исследуемую сыворотку в различных разведениях (в 2, 4, 8, 16 и 32 раза). Результат определяют через сутки инкубации при комнатной температуре. При повышении в сыворотке ПДФ более 0,016–0,020 г/л на агаровой пластинке определяются дуги преципитации. Если известна чувствительность стандартной антифибриногеновой сыворотки, иммунодиффузный метод позволяет количественно определять содержание ПДФ в исследуемой сыворотке.

!!! Повышение концентрации ПДФ в сыворотке крови более 0,015 г/л чаще всего наблюдается:
при ДВС-синдроме
при массивных тромбозах и тромбоэмболиях, сопровождающихся активацией фибринолиза
при лечении фибринолитическими препаратами

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АНТИКОАГУЛЯНТЫ

В условиях физиологической нормы постоянно встречаются ситуации, которые «запускают» процесс плазмокоагуляции. Ограничение этого процесса осуществляется с помощью так называемых физиологических антикоагулянтов, которые, будучи естественными ингибиторами различных факторов коагуляции, тормозят начавшееся свертывание крови.

Различают две группы физиологических антикоагулянтов:
1.первичные , постоянно содержащиеся в крови - антитромбин III, гепарин, протеин С, a2-макроглобулин и др.
2.вторичные - образующиеся только в процессе свертывания крови и фибринолиза

Антитромбин III является важнейшим ингибитором свертывания, на долю которого приходится 3/4 активности всех физиологических ингибиторов коагуляции. Он инактивирует все ключевые факторы свертывания: тромбин (IIа), фактор Ха, IХа, ХIа, VIIa, XIIa. Кроме того, антитромбин III является плазменным кофактором гепарина, образуя с ним комплекс, обладающий выраженными антикоагулянтными свойствами. Антитромбин III и гепарин взаимодействуют с факторами свертывания и порознь, но в этом случае ингибирование обратимо.

!!! Дефицит антитромбина III (наследственный или приобретенный) сопровождается тяжелым тромботическим состоянием, характеризующимся рецидивирующими тромбозами магистральных вен конечностей и внутренних органов, тромбоэмболиями легочной артерии, инфарктами различных органов. При этом антикоагулянтная активность гепарина, вводимого парентерально, резко снижается из-за отсутствия кофактора - антитрипсина III.

К другим первичным антикоагулянтам относятся:
гепарин - ингибитор поливалентного действия, ограничивающий все фазы плазмокоагуляции, особено в комплексе с антитромбином III
a2-макроглобулин - белок, являющийся ингибитором тромбина, плазмина, калликреина
протеин С - витамин-К-зависимый физиологический антикоагулянт, инактивирующий факторы VIII и V при участии двух кофакторов (протеина S и тромбомодулина).
a-антитрипсин I - ингибитор тромбина, факторов IXa, XIa, XIIa, плазмина и калликреина и др

Из вторичных физиологических антикоагулянтов, образующих в процессе начавшегося свертывания и фибринолиза, наибольший практический интерес вызывают:
фибрин - обозначаемый антитромбином I
продукты деградации фибриногена/фибрина (ПДФ)

!!! Образующийся в процессе коагуляции плазмы фибрин и являющийся по сути конечным продуктом этого процесса одновременно адсорбирует и инактивирует большие количества тромбина и фактора Ха, т. е. функционирует и как физиологический антикоагулянт.

!!! Продукты деградации фибриногена/фибрина (ПДФ), образующиеся в результате действия плазмина, ингибируют как агрегацию тромбоцитов, так и процесс полимеризации фибрин-мономеров, т. е. конечный этап свертывания - образование фибрина.

В клинической практике наибольшее распространение в последние годы получило определение функциональной активности антитромбина III как важнейшего физиологического антикоагулянта. Методы основаны на оценке интенсивности инактивации стандартных доз тромбина с регистрацией по времени свертывания или на количественном определении содержания в плазме антигена антитромбина III с применением стандартных антисывороток (иммунологический метод).

Время свертывания - это время, которое проходит от момента взятия образца крови из вены до её полного сгущения в пробирке. Процесс свертывания крови может быть осуществлен путем примесной активации (на основе тканевого тромбопластина) или путем эндогенной активации (при контакте с отрицательно заряженной поверхностью, например, коллаген в поврежденной стенке сосуда).

Активация этих систем запускает каскад реакций, в которых основную роль играют факторы свертывания плазмы. Именно они приводят, в конечном итоге, к трансформации фибриногена в фибрин, который образует сгусток крови и останавливает кровотечение.

Время свертывания крови используется для оценки правильного протекания всех этих процессов. Причиной его продления может быть, например, дефицит какого-либо из факторов плазмы, участвующих в процессе свертывания крови .

Следует, однако, помнить, что из-за отсутствия стандартизации метода и низкой воспроизводимости метода определения результатов, а также из-за наличия более совершенных методов, время свертывания теперь используется редко.

Определение и допустимое время свертывания крови

Время свертывания исследуют на пробе венозной крови, взятой из локтевой вены. На забор крови для исследования необходимо приходить натощак, последний прием пищи следует проводить не позже, чем за 8 часов перед исследованием.

Время свертывания крови оценивается, чаще всего, методом Ли-Уайта . Этот метод позволяет оценить эффективность всей системы коагуляции , с акцентом на активность фактора Хагемана (это двенадцатый фактор свертывания крови).

Если измерение проводится в стеклянных пробирках, в зависимости от температуры, правильные значения составляют 4-10 минут (при температуре 37 градусов), а 6-12 минут (при температуре 20 градусов).

Следует, однако, помнить, что из-за трудностей в стандартизировании метода, трудно однозначно определить правильное значение времени свертывания крови и, следовательно, результаты могут отличаться в различных лабораториях.

Кроме того, необходимо учитывать, что на время свертывания крови влияют такие факторы, как:

• размер пробирок;
• тип материала, из которого была сделана пробирка (стекло, силикон);
• тип стекла, из которого выполнена пробирка.

Учитывая все эти зависимости и большое расхождение результатов измерения времени свертывания крови, он был заменен тестом на протромбиновое время и активированное частичное тромбопластиновое время.

Интерпретация результатов времени свертывания крови

Удлинение времени свертывания крови происходит в случаях:

• лечение гепарином - это вещество, которое тормозит процесс свертывания, а его применение требует мониторинга системы гемостаза; однако, из-за вышеупомянутой трудности в определении времени свертывания, как правило, используется для контроля лечения нефракционированным гепарином; для этого используется тест АЧТВ. Если, однако, даже если мы используем определение времени свертывания в случае использованиягепарина должна быть расширена с 1,5 до 3 раз нормальные значения;; если, однако, несмотря на это, мы используем определение времени свертывания, в случае применения нефракционированного гепарина допустимые значения должны быть увеличены в 1,5 - 3 раза;
• дефицит факторов свертывания - II, V, VIII, IX, X, XI, XII - дефицит этих факторов приводит к возникновению плазменного диатеза - причиной его возникновения может быть нарушение синтеза этих факторов в ходе различных заболеваний печени;
• гемофилия - врожденный изъян системы свертывания крови, вызванный дефицитом факторов VIII, IX или XI; болезнь требует постоянного пополнения недостающего фактора, особенно перед планируемыми процедурами или хирургическими операциями, в противном случае доходит до угрожающих жизни кровотечений;
• циркулирующие антикоагулянты - антифосфолипидные антитела, появляющиеся при антифосфолипидном синдроме и системной красной волчанке .

Помните, что правильное время свертывания крови не указывает на отсутствие нарушений гомеостаза. Результат исследования на свертываемость крови может быть фальсифицирован, если проводить его во время менструации и в период беременности.

Коагулограмма.

Наиболее часто применяемые тесты для исследования гемостаза:

1. Время свёртывания венозной крови по Ли-Уайту – это время образования сгустка в одном миллилитре нативной венозной крови больного в стеклянной пробирке при 37C в норме 5-8 минут. Это ориентировочный общекоагуляционный тест, т.е. характеризует систему свёртывания крови в целом при нормальных показателях этот тест даёт информацию о том, что ПТИ больше 30%, фибриноген больше 1 г/л.
2. Время рекальцификации плазмы – это время свёртывания плазмы больного (полученной из крови, стабилизированной раствором цитрата натрия) при добавлении к ней раствора хлористого кальция. В норме 120-150 сек. Это является ориентировочным общекоагуляционным тестом.
3. Активированное время рекальцификации – это время свёртывания плазмы больного (полученной из «цитратной» крови) при добавлении навески каолина (каолин – белая глина, это поверхностно-активное вещество, применяемый для контактной инактивации свёртывания с целью более точного выявления нарушений в фазах свёртывания крови) после рекальцификации добавлением хлористого кальция. В норме 60-80 сек. Является точным и чувствительным методом.
4. Определение содержания фибриногена по Р. Л. Рутбергу. Метод основан на рекальцификации одного миллилитра цитратной плазмы и взвешивании образовавшегося сгустка фибрина (после отжатия из него жидкой фазы). Вес такого сгустка в норме 9-18 мг., что по калибровочным кривым соответствует концентрации фибриногена 2-4 г/л.
5. Паракоагуляционные тесты (В – нафтоловый, этаноловый, протаминсульфатный) – выявляет наличие в крови больного РКМФ (растворимый комплекс мономеров фибрина – это комплекс мономеров и частичных полимеров (неполных), растворимых в воде, старое название флобриноген В ). Наличие РКМФ в крови говорит о возможности или присутствии тромбонов либо ДВС. К цитратной плазме больного добавляют соответствующий реактив (В – надолол, протаминсульфат или 50%-ы й этанол). При наличии РКМФ мономеры фибрина высвобождаются, действие свёртывающих компонентов плазмы полимеризует эти мономеры с образованием сгустка. В норме РКМФ в крови нет, поэтому в процессе теста сгусток не образуется.
6. Фибриноген В – это РКМФ. В норме отсутствует. При его наличии, выражаемом плюсами, имеется гиперкоагуляция, с возможным или явным тромбозом.
7. Протромбиновое время (синоним – протромбиновый индекс) – это время свёртывания цитратной плазмы после внесения в неё стандартного раствора тромбопластина и хлористого кальция. Характеризует активность VII, X, V, II факторов протромбинового комплекса, которые является витамин К - зависимым. Поэтому тест широко применяется для контроля терапии непрямыми антикоагулянтами (антивитаминами К). При применении высокоактивного стандартного тромбопластина результат выражают в секундах (в норме 12-15 с.), но в связи с несоответствием большинства отечественных тромбопластинов стандарту результат выражают относительно в процентах или единицах протромбинового времени плазмы. Норма 80-100% или 0,8-1,1. Выше 110% результат быть не может, иначе это ошибка лаборатории.
8. Активированное частично (парциально) тромбопластиновое время – АЧТВ и АПТВ – синоним каолин-кефалиновое время плазмы. Кефалин – взвесь фосфолипидов, необходимых для свёртывания крови. Так же как и каолин, кефалин применяется для сокращения свёртывания в тесте, следовательно, для стандартизации и повышения точности теста. В данном случае в цитратную плазму до рекальцификации вводят навеску каолина (каолиновое время 60-70 сек.) и кефалин (кефалиновое время (если вводят только кефалин) синоним парциальное тромбопластиновое время, норма 55-56 сек.). В норме АЧТВ (т.е. с добавлением каолина и кефалина) – 35-45 сек. Кефалин является заменителем тромбоцитарного фактора 3. Тест весьма чувствителен к плазменным дефектам (дефицит XII, XI, IX, VIII, а так же к избытку антикоагулянтов). При лёгкой гипокоагуляции АЧТВ – 50-60 сек., средняя – 80-90 сек., выраженная более 90 сек. При гиперкоагуляции АЧТВ – менее 30 сек.
9. Определение количества тромбоцитов в крови. В норме (180-320)*10^9/л. Считают в камере или в мазке.
10. Определение времени кровотечения (по методу Дьюка, Борхгревинна, Айви и др.). Это время кровотечения из раны на нож (прокол или небольшой разрез-царапина) при обычном венозном давлении или при накладывании на плечо манжетки, в которой создаётся давление 40 мм рт.ст. Норма до 5 минут (при накладывании манжетки до 8 минут). Характеризует суммарное состояние сосудисто-тромбоцитарного гемостаза.
11. Тромбоцитарное время свёртывания плазмы. Это время свёртывания нормальной плазмы при добавлении раствора тромбина в равных объёмах. Даёт представление о состоянии ___________ этапа свёртывания. В норме 14-16 сек. При гиперкоагуляции – укорачивается, при гипокоагуляции – удлиняется.
12. Аутокоагуляционный тест. 0,1 мл цитратной крови больного смешать с двумя мл 0,222% гипотонического раствора CaCl2 образуется гемолизат – кальциевая смесь, в которой начинается процесс активации протромбина и превращения его в тромбин. К плазме больного добавляют этот гемолизат в разные сроки (2-й, 4-й,6-й, 8-й, 10-й, 20-й, 30-й, 40-й, 50-й, 60-й минутах или чаще только на 8-й и 10-й минутах). Строят график, который показывает нарастание активности тромбопластина и тромбина, а так же скорость инактивации тромбина антитромбинами и продуктами фибринолиза.

Характеризует гипокоагуляцию в норме на 8-й и 10-й мин. 7-11 сек.

13 Антитромбин III – первичный антикоагулянт плазмы крови. Исследуемая плазма дефибринируеттся (прогреванием, змеиным ядом или другими способами), затем добавляют стандартное кол-во тромбина (можно добавлять активированный фактор Xа, который так же блокируется антитромбином III ,-это вариант метода). Смесь инкубируют при 37С, а затем тестируют на растворе фибриногена или адсорбированной плазме через каждые 3 мин. в течении 9 мин. Об уровне антитромбина III по ослаблению свертывающей активности тромбина (количественное определение по калибровочной кривой). В норме 90-100 %. Гепарин действует только в присутствии антитромбина III (при соединении с ним).

14 Толерантность плазмы к гепарину - это время свертывания цитратной плазмы при внесении в нее небольших количеств гепарина и последующей рекальцификации. В норме 5-7 мин. Это общекоагуляционный тест, но более чувствительно отражает наклонность к тромбообразованию, при этом тест менее 5 мин., что по-видимому связано со снижением антитромбина -III.

15 Ретракция кровяного сгустка - это часть жидкости, отжатой сгустком при сокращении от количества плазмы. В норме 65 – 85 %. Менее 65% - сгусток дряблый, более 65% - плотный. Тест весьма неточен, малоинформативен, зависит от качества стекла и других лаб. принадлежностей, а так же биохимических показателей крови.

16 Спонтанный фибринолиз - это кол-во эритроцитов, выпавших из сгустка в процессе ретракции и лизиса, т.е. «мера спонтанной разрушаемости сгустка» при инкубации 37С 2 часа, (можно 3 часа). Метод неточен, неверен, т.к. показано, что формирование осадка _____________ эритроцитов не связано с фибринолизом. В норме 10-20%

17 Эуглобулиновый метод определения фибринолитической активности (син-эуглобулиновый тест). Это время растворения сгустка эуглобулинов, осажденных из исследуемой плазмы уксусной кислотой и свертываемых хлористым кальцием (или тромбином). По способу Коваржика-Булука: в кислой среде при низкой температуре осаждается эуглобулиновая фракция(это плазминоген, его активаторы, факторы свертывания, фибриноген). В осадок выпадают ингибиторы фибринолиза в очень малом количестве. Эуглобулиновую фракцию растворяют, затем вызывают в ней свертывание (добавлением хлорида Са или тромбина), определяют время лизиса полученного сгустка при 37С. В норме 3-4 часа(2-4, в среднем 3 часа). При повышении фибринолитической активности лизис ускоряется, при дефиците плазминогена и его активаторов замедляется. Используется методика для определения активности фибринолитической системы.

18 Клинические пробы щипка, жгута, баночная проба Нестерова. Показывают состояние проницаемости сосудистой стенки под влиянием относительно дозированного воздействия (щипок кожи, наложение жгута на плечо, присасывающее действие «банки» при разряжении воздуха в ней). Дают грубую, но часто важную информацию о состоянии сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Результат оценивают по количеству петехий, появляющихся на исследуемом участке кожи после механического воздействия.