Генная терапия, или как загнать днк в клетку и вылечить этим пациентов. Генная и клеточная терапия моногенных и мультифакторных заболеваний Лечение генетических заболеваний помощью вирусов
Первая часть (до синей линии) это введение в генотерапию, в принципе, чтобы лучше понять сами методы, и, чуть что, не быть словленным преподавателем. Если нету времени и нужен КОНКРЕТНО материал по вопросу, пролистывайте сразу за синюю линию.
Генная терапия первоначально нацеливалась на лечение моногенных наследственных заболеваний, но затем область её применения расширилась, и она стала рассматриваться как потенциально универсальный подход к лечению всего спектра болезней, включая также инфекционные заболевания, рак, атеросклероз, диабет и ряд других.
«Лечение генов» - исправление дефекта в гене (моногенные болезни) – на уровне соматических и половых клеток – замена мутантного гена на нормальный.
«Лечение генами» - коррекция дефекта путем введения полноценного работающего гена (кДНК).
Сначала немного общей теории:
Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии).
Стратегии коррекции генетических дефектов:
По типу векторной системы:
Вирусная
Преимущества вирусных векторов : трансдукция большого числа клеток; тропизм; устойчивость к лизосомной деградации.
Недостатки вирусных векторов : иммуногенность (со смертельными исходами – адено- и герпесвирусы); потенциальная канцерогенность (ретровирусы).
Невирусная
· Прямая инъекция в клетку, ткань, орган (она же микроинъекция);
· Липофекция (с помощью различных модифицированных липосом (липидных пузырьков с ДНК внутри);
· Электропорация;
· В составе плазмиды;
· Комплексиррованная ДНК(плазмидная ДНК, соединенная с солями, белками и тд.);
· Генное ружье (ДНК присоединено к золотым частицам, выстреливаемых в ткани пациента);
· Рецептор-опосредованный эндоцитоз.
Преимущества невирусной доставки : относительная безопасность; отсутствие иммунного ответа; простота применения.
Недостатки невирусной доставки : низкая эффективность трансфекции; низкий уровень экспрессии.
Теоритически наиболее радикальным и эффективным способом является замена дефектного гена в половых клетках (фетальная генотерапия), однако есть этические проблемы. На данный момент все геннотерапевтические подходы базируются на генотерапии на уровне соматических клеток.
По механизму действия встраиваемого гена или переносимой молекулы ДНК, генотерапия делится на положительную (восстановление функции гена(через восстановление его работы или вставки новой рабочей копии) или отрицательную – подавления функции гена). Плюс существует подход направленный на усиление иммунного ответа, который используется в основном в генотерапии рака (об этом ниже).
Так же новую ген информацию можно вносить в организм человека, в составе его же предварительно трансформированных in vitro клеток г.з. ex vivo подход. Подход, при котором, ген информация вводится непосредственно в клетки живого человека, называется (внезапно) in vivo, локальное введение в какие-то определенные участки называется in situ. На данный момент существуют успешные прецеденты введения ген информации in utero (в эмбрион), в Великобритании, совсем недавно спасли ребенка от митохондриальной болезни.
Дополнительные генотерапевтические подходы:
· Антисенс ДНК, РНК (+): специфичность, можно исп в любом векторе, неиммунногенные; (-): быстрая деградация в клетке);
· Рибозимы (+): обладают свойствами ферментов – не расходуются, способны к катализу расщепления мишени, в отличие от белков неиммунногенны, индуцируют синтез интерферона; (-): быстрая деградация;
· Трансдоминантные негативные белки;
· Одноцепочечные антитела;
· Суицидные гены (вместо «лечения» клетки, ее можно просто убить, используется в антираковых системах, (подробнее будет ниже);
· Введение антиген-специфичных лимфоцитов;
· Химеропластика (гибриды ДНК/РНК шпилечной структуры, производят гомологичную рекомбинацию в ядре);
Тут идут исключительно примеры генотерапевтических методов, описания заболеваний смотрите в предыдущих по нумеровке билетах.
Моногенные заболевания:
Недостаточность аденозиндезаминазы (АДА синдром) – первый относительно удачный пример использования генотерапии. Она была осуществлена 14 сентября 1990 года. Эта дата считается днем рождения реальной генной терапии.
С помощью лейкофореза из периферической крови выделяли мононуклеарные клетки, затем их растили в культуре в условиях пролиферации Т-клеток. Затем в пролиферирующие в условиях in vitro клетки вводили ретровирусный вектор, который содержал нормальный ген ADA. Через несколько дней трансдуцированные клетки крови вводили обратно пациентке. Процесс повторяли 7 раз на протяжении 10 месяцев. Эффект был положительным, ¼ лифоцитов в организме получили рабочий ген. Раз в 3-5 месяцев введение модифицированных клеток повторяли. В настоящее время генная терапия данного заболевания развивается в направлении использования стволовых клеток пациента. Это позволит значительно сократить количество введений модифицированных клеток за счет их многократных делений уже в самом организме и при достижении селективного и количественного преимущества модифицированных стволовых клеток над нативными сформирует достаточный уровень фермента в организме.
Наследственная гиперхолестеролемия - Известно, что неделящиеся гепатоциты не могут быть инфицированы ретровирусами. После гепатоэктомии гепатоциты начинают пролиферировать и приобретают способность инфицироваться ретровирусами. В гепатоциты, полученные из печени больного, с помощью ретровирусного вектора была введена кДНК гена нормального рецептора LDL-R. После реинфузии рекомбинантных гепатоцитов через воротную вену в печень наблюдалось уменьшение содержания в крови липопротеинов низкой плотности (в частности, холестерина) и соотношения липопротеинов низкой плотности к липопротеинам высокой плотности. Это означает, что введенные клетки функционировали in vivo и осуществляли интернализацию и обмен холестеринов.
Гемофилия В –
Были проведены успешные опыты на собаках с использованием стратегии ех vivo с
доставкой в гепатоциты кДНК, кодирующей фактор IX. Удалось добиться синтеза фактора IX в количествах, составляющих 0,1% от нормального количества фактора IX в плазме крови. При попытке повысить концентрацию фактора IX были использованы аденовирусные векторы, однако эффект был недолговременным. Кровь животных свертывалась, однако эффект полностью пропадал после 2х месяцев (типичный недостаток аденовирусных векторов).
Гемофилия A - Появились сообщения об успешном введении мышам укороченного гена фактора VIII в составе ретровирусного вектора. В результате достигается терапевтический уровень фактора в крови.
Муковисцидоз - Показано, что замена 6-10% клеток легочного эпителия трансфецированными клетками позволит восстановить нормальные транспортные функции трансмембранных каналов, обеспечивающих перенос ионов хлора. Ретровирусы не подходят, так как не ифицируют неделящиеся клетки, аденовирусы подходят с оговорками, так как в опытах на мышах вызывали воспалительные реакции. Проблема дополнительно заключается в барьере из гликокаликса на поверхности клеток. Один из подходов для решения данной проблемы заключается в модификации вектора, который включает в себя определенный лиганд к рецептору на поверхности клеток легочного эпителия. Взаимодействие лиганда с рецептором обычно приводит к интернализации вектора вместе с рецептором внутрь клетки. В качестве такого рецептора был выбран трансмембранный рецептор P2Y2-R. Этот рецептор участвует в запуске каскада воспалительных реакций в полости легких. В качестве лиганда использовались либо моноклональные антитела к этому рецептору, либо природный лиганд - биотинУТФ.
Мышечная дистрофия Дюшена - Болезнь начинает проявляться в детстве, и генная терапия должна проводиться в это же время. Наиболее перспективным является использование аденовирусных векторов. Из-за большой длины гена, исследователи используют укороченные, но функциональные копии белка. ксперименты на мышиных моделях, которые имеют дефектный ген дистрофина, показали, что от 5 до 50% мышечных клеток экспрессировали усеченный белок дистрофин. Этого было достаточно для сведения к минимуму мышечной дегенерации. Существуют данные о клинических испытаниях генетической конструкции, несущей ген дистрофина, для терапии больных мышечной дистрофией Дюшена. Больные дети после инъекции в мышцы такой конструкции приобретали способность двигаться. Однако, эффект был кратковременным.
Многофакторные заболевания на примере онкологических заболеваний:
Рак это, как правило, следствие многоступенчатых изменений клетки. Сложность, связанная с участием множества генов и их продуктов в опухолевом процессе, вызывала сомнения в эффективности генной терапии раковых заболеваний. Однако, существуют многочисленные эксперименты, показывающие, что компенсация единственного гена-супрессора может приводить к подавлению опухолевых свойств клеток.
Иммунотерапия рака:
Использование генотерапевтических конструкций, стимулирующих иммунный (в основном клеточный) противоопухолевый ответ. Для создания ген-конструкций используют гены: Антигенов (на который срабатывает иммунная система); Комплекса MHCI(главный комплекс гистосовместимости); фактора B7; Цитокинов; Рецепторов Т-клеток. Подавление развития опухоли может быть достигнуто клонированием генов цитокинов: интерлейкинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, а также фактора некроза опухолей –α (TNF- α), интерферонов (INF- α, INF-ϒ)
Подавление роста раковых клеток введением в них генов, продукты которых подавляют развитие опухоли:
· Гены-супрессоры опухоли (RB, P53, mdm2, Cip 1, P16, Cyclin D)
· Суицидные гены
· Ингибиторы онкогенов
· Факторы антиангиогенеза
· Ингибиторы циклинов
· Гены, повышающие чувствительность клеток опухоли к лекарственным соединениям
· Гены транспортеров лекарственных соединений (введение, например, в клетки костного мозга)
Колоссальное значение имеет в подавлении онкогенов ген p53(отвечает за апоптоз и способен остановить клеточный цикл, предотвращая бесконтрольное деление), поэтому его мутация практически всегда ведет в злокачественному перерождению клетки. Для внесения рабочей копии гена p53 в организм используются аденовирусные вектора. После начала экспрессии гена p53 в ядре раковой клетки, он индуцирует ее апоптоз.
Другим подходом является подавление работы онкогенов . Мутация в гене RAS способна привести к конститутивной работе сигнальной системы запуска деления (MAP киназный каскад, вспоминаем Николайчика J). Чтобы заблокировать этот ген, можно 1)ингибировать экспрессии RAS введением интактного гена; 2)ингибирование RAS рибозимами; 3)ингибирование нижележащих в сигнальном пути генов; 4)препятствие встраивания RAS белка в мембрану.
Использование онколитических вирусов. Вирусный онколизис - это принципиально новый подход к терапии онкологических заболеваний, основанный на естественной способности вирусов убивать (лизировать) клетки, в которых он размножается. Для этого используются реовирусы, полиовоирусы, эховирусы и вирусы Коксаки + некоторые модифицированные аденовирусы, которые преимущественно размножаются в опухолевых клетках и ведут их к апоптозу. В настоящее время проводятся клинические испытания препарата REOLYSIN, выпускаемого компанией Oncolytic Biotech. Очень перспективными считаются аденовирусы, экспрессирующие антиангиогенные белки.
30 августа 2017 года Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (FDA) одобрена первая в мире генная терапия рака крови . Речь идет о Kymriah (tisagenlecleucel) компании Novartis Pharmaceuticals, который создан на основе технологии CAR-T и предназначен для лечения В-клеточного острого лимфобластного лейкоза у детей и молодых взрослых пациентов до 25 лет, рефрактерным к другим методам лечения или имеющим рецидив заболевания.
Использование технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 открывает новые возможности в генной терапии. CRISPR/Cas9 позволяет очень точно и безопасно изменять ДНК клеток. И если совместить технологию CRISPR/Cas9 с доставкой при помощи аденоассоциированных вирусов, то это, по-видимому, позволит системно воздействовать на организм и совершенно безопасно изменять геном очень большого числа клеток.
И вот в 2016 году генетики из университета Дьюка (США) объявили, что им впервые в истории удалось успешно провести генную терапию взрослого млекопитающего (мыши) и вылечить его от генетического заболевания, связанного с дистрофией мышц. Для этого была использована модифицированная версия сравнительно новой технологии редактирования генов CRISPR/Cas9. Технология редактирования генов CRISPR/Cas9 связана с использованием аденоассоциированного вируса, помогающего доставлять генетический материал до места назначения. При помощи этой технологии были проведены успешные опыты по редактированию генов отдельных клеток в пробирках и одноклеточных эмбрионов. К сожалению, пока что возможность генетических манипуляций на эмбрионах человека вызывает ожесточённые споры.
CRISPR/Cas превзошел все ожидания. Он позволила с минимальным числом ошибок как «выключать» нужные гены, так и встраивать новые гены в строго определенные участки генома.
В декабре 2015 года научная группа Фенга Джанга видоизменила данную систему так, что она стала и вовсе безошибочной, что было опубликовано в ведущем научном журнале Science. Ученые заменили 3 аминокислоты «кирпичики», из которых состоит белок) в эндонуклеазе Cas9, после чего число ошибок такой системы свелось практически к нулю.
Использование CRISP/Cas9 особенно актуально для генной терапии старения, где требуется воздействовать на пути долголетия, общие для большинства клеток организма. По генной терапии старения до 2015 года не проведено ни одного клинического испытания на людях, что неудивительно, поскольку старение до сих пор не признано болезнью.
Кроме того, генная терапия старения пока еще очень молодая и развивающаяся область. Сейчас все исследования по генной терапии старения проводятся на модельных мышах, крысах, обезьянах и клеточных культурах человека - клетках в пробирке.
Все подходы к генной терапии старения делятся на те, где в организм доставляется ген долголетия, и на те, где вводятся малые РНК, «выключающие» ген или путь старения. То есть в первом случае вводится нечто полезное для долголетия, а во втором - отключается вредное. В строгом смысле исследований по генной терапии старения на млекопитающих до 2015 года было проведено только два.
Гораздо больше работ моделируют генную терапию на трансгенных мышах. В таких исследованиях терапевтический ген не доставляют в организм взрослой мыши, а при помощи генной инженерии создают мышей, геном которых изменен с рождения. Как и генная терапия, это позволяет исследовать, как увеличение или снижение активности разных генов влияет на продолжительность жизни и старение организма.
Давайте рассмотрим, что можно теоретически сделать с помощью генной терапии и генной инженерии для борьбы со старением.
Преимущество генной терапии перед другими способами продления жизни
Зачем нам генная терапия, если можно использовать препараты от старения (геропротекторы)? В сравнении с другими подходами к продлению жизни (например, геропротекторами или ограничением питания , продлевающими жизнь до 30-50%) генную терапию достаточно провести только один раз за всю жизнь, а таблетки нужно пить всё время и не забывать - иначе и результат будет не полным. Например, в работе Андржея Бартке 2001 года ограничение питания продлило жизнь мышам на 30% . Однако мыши употребляли низкокалорийную диету до 670 дней подряд - то есть каждый день, в течение половины своей жизни! Для большинства людей - это мало реально. А в эксперименте по генной терапии Марии Бласко (будет рассмотрено дальше в этой статье) 2012 года генная терапия теломеразой привела к немного меньшему эффекту - мыши стали жить дольше на 20%. Однако в этой работе мыши получили только 1 инъекцию лекарства в кровь за всю жизнь в довольно преклонном возрасте!Поэтому, если мы говорим о трансляции исследований по продлению жизни на человека, то генная терапия имеет абсолютное преимущество, поскольку не снижает качество жизни из-за необходимости постоянного лечения - соблюдать ежедневно определенную диету или же постоянно употреблять геропротекторы или другие лекарства. Также генная терапия высокотаргетна и поэтому имеет потенциал к меньшему числу побочных эффектов.
Кроме того, лекарственные средства имеют ограничения по биодоступности в различные ткани и органы.
Внедрение гена теломеразы (TERT) у двухлетних мышей дикого типа (40-50 лет по человеческим меркам) с помощью одной инъекции увеличивает длину теломеров и продлевает им жизнь на 20%.
Ученый предположил, что в клетках существует некий счетчик делений, ограничивающий их общее число. Спустя 10 лет российским ученым Алексеем Оловниковых был предложен гипотетический механизм работы этого счетчика.
Оловников предположил, что при делении клеток концы хромосом, называемые теломерами, немного сокращаются. А когда теломеры достигают критической длины, клетка перестает делиться и стареет. В дальнейшем Элизабет Элен Блэкбёрн - американский учёный-цитогенетик, стала лауреатом Нобелевской премии по физиологии или медицине за 2009 год совместно с Кэрол Грейдер и Джеком Шостаком с формулировкой «за открытие механизмов защиты хромосом теломерами и фермента теломеразы» по теории, в 1971 году предложенной Алексеем Оловниковым.
В нестареющих клетках (например, половых и эмбриональных стволовых), напротив, должен существовать фермент, который удлиняет теломеры, позволяя клеткам делиться практически до бесконечности. Кроме того, было показано, что повреждение гена теломеразы сильно сокращает жизнь модельных животных и приводит к возникновению синдрома преждевременного старения - прогерии.
После открытия теломеразы десятки ученых загорелись тем, чтобы сделать на ее основе лекарство от старости. Казалось бы, «включение» теломеразы во всех клетках может сделать организм бессмертным. Однако вскоре возникли опасения в связи с тем, что активный синтез теломеразы наблюдается и в 90% раковых опухолей. Встал вопрос: не приведет ли активация теломеразы к риску злокачественной трансформации?
Кроме того, оказалось, что старение клеток далеко не всегда сопровождается сокращением теломер. Например, в случае эпителиальных клеток слизистой полости рта или роговицы глаза человека. Это говорило о том, что одной активации теломеразы может быть недостаточно для омоложения всего организма. Перед тем как перейти к генной терапии, эффекты теломеразы исследовались на трансгенных мышах. Оказалось, что если «включить» ген TERT во всех клетках мыши, то продолжительность жизни увеличивается на 40%! Однако постоянная активность теломеразы увеличивала и риск рака. Поэтому стал вопрос о том, как активировать работу теломеразы на более короткий срок.
Именно это было сделано в работе Марии Бласко 2012 года (см. график). Ген теломеразы доставлялся в организм мыши при помощи аденоассоциированного вируса (AAV9), способного обеспечивать системную доставку. Аденоассоциированные вирусы характеризуются высокой безопасностью: они не встраивают доставляемый ген в геном хозяина, и поэтому не приводят к мутагенезу (нет риска рака). Кроме того, они почти не вызывают иммунный ответ. При этом, терапия геном TERT оказалась совершенно безопасной: риск рака у мышей не увеличивался. Двухлетним мышам делалась одна инъекция, с аденовирусом, к которому вставлен ген теломеразы. Это продлевало жизнь мышам на 20 % (как показано на графике выше). А это теоретически может позволить сделать людям в возрасте 40-50 лет одну инъекцию такого лекарства и продлить жизнь ещё на 8-12 лет.
Сегодня простимулировать теломеразу можно и лекарствами. Интересное исследование в этой области провели ученые из Университета Любляны (Словения) в 2016 году после ряда успешных клинических испытаний по омоложению сосудов низкими дозами валсартана и флувастатина. На этот раз они измерили активность теломеразы после омоложения сосудов в образцах крови 130 пациентов пациентов.
Так одномесячный курс существенно повышает активность теломеразы в 3.28 раза , которая достоверно коррелирует с улучшением эндотелиальной функции (омоложением сосудов) и снижением воспаления в кровеносных сосудах. И этот повышенный уровень теломеразы сохраняется, постепенно снижаясь, ещё полгода. Но насколько эффективно такое повышение теломеразы влияет на теломеры ещё предстоит определить.
Важно знать, что теломеры не обязательно могут продлить нам жизнь, если подобную терапию делать не в нужный момент и слишком долго.
К тому же одна лишь стимуляция теломеразы может не удлинить теломеры. Активность теломеразы с возрастом почти не меняется - вот посмотрите график слева. А теломеры всё равно сокращаются.
Также сегодня есть на рынке препарат, который повышает активность теломеразы - ТА-65. Он очень дорогой, а жизнь мышей никак не продлевал в исследованиях. Вот смотрите график слева. В исследовании 2011 года ученые из Испанского Национального Онкологического Центра начали давать долгоживущим двух летним мышам ТА-65 для повышения теломеразы, как и в предыдущем исследовании. Только в предыдущем исследовании мышам делали инъекцию для генной терапии. Но препарат ТА-65 никак не продлил жизнь мышам в отличие от генной терапии (см. график слева) и оказался абсолютно бесполезным для продления жизни и замедления старения.
В 2011 году ученые из Техасского Университета исследовали теломеры и теломеразу в культурах клеток более 60 видов млекопитающих . Роль теломер в долголетии оказалось не так очевидна… Исследования показывают (при сравнении около 60 видов млекопитающих), чем длиннее теломеры у вида, тем быстрее накапливаются у него мутации ДНК, больше раковых опухолей и короче продолжительность жизни. Длина теломер обратно коррелирует с продолжительностью жизни. Это даёт основания предполагать, что результат по продлению жизни теломеразой, который был получен на мышах с помощью одной инъекции, может не продлить жизнь людям. Вопрос по теломерам для людей остаётся открытым.
Вывод: В будущем теоретически мы сможем с помощью внедрения гена теломеразы (TERT) в возрасте 40-50 лет с помощью одной инъекции увеличивать длину теломеров, но одной такой терапии явно недостаточно. Быстрее всего, мы должны найти сочетание генотерапевтических воздействий, чтобы существенно продлить жизнь человека. Сегодня мы можем имитировать эффект с помощью одномесячной терапии 1 раз в полгода комбинацией препаратов валсартана 20 мг + флувастатина 10-20 мг , либо телмисартан + аторвастатин 10 мг. По крайне мере эти препараты в комбинации способны стимулировать саму теломеразу.
Нарушение работы гена Agtr1a, кодирующего рецепторы ангиотензина AT1a продлевает жизнь трансгенным мышам на 26% в сравнении с мышами дикого типа.
Антагонисты рецепторов ангиотензина II, или блокаторы АТ1-рецепторов - одна из новых групп антигипертензивных средств (лекарства для лечения артериального давления). К таким лекарствам можно отнести все лекарства группы сартанов (например, телмисартан) .Каплан на примере приматов показал, что если собрать группу самцов приматов, то в течение скольких-то дней у обезьян появится социальная иерархия. Самое худшее место в такой иерархии - это внизу. Самцы приматов, находящиеся в подчиненном положении, демонстрируют ряд показателей хронического стресса. Часто у них возникает атеросклероз. Когда учёные давали самцам приматов, находящимся внизу социальной иерархии (группа риска), бета-блокатор пропранолол , подавляющий активность симпатической нервной системы, то атеросклероз сосудов не развивался.
Оказалось, что симпатическая нервная система из-за стресса негативно влияет на развитие атеросклероза и участвует в проблемах с сердцем и сосудами. Эмоциональный стресс реализует себя через симпатическую (адренергическую) автономную нервную систему, которая связывает управляющие центры нашего мозга и внутренние органы. В том числе - с иммунными, костным мозгом и др. Атеросклероз - главный фактор, который приводит к наибольшему число смертей в развитых странах от инфаркта сердца и инсульта мозга.
Рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование 1983 года , организованное Goldstein S и коллегами, показало, что терапия пропранололом у 3837 пациентов с острым инфарктом миокарда снижает смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (причина смертности №1 в мире).
В марте 2017 года, французские ученые сообщили об успешных клинических исследованиях генной терапии для лечения серповидноклеточной анемии.
Комитет Американской Национальной Академии наук и Национальной Академии медицины дал поддержку редактирования генома человеческих эмбрионов уже в 2017 году . Но только для серьезных заболеваний и под строгим контролем.
Выводы
1. Все подходы к генной терапии старения делятся на те, где в организм доставляется ген долголетия, и на те, где «выключается» ген или путь старения.
2. В сравнении с другими подходами к продлению жизни генную терапию достаточно провести только один раз за всю жизнь.
3. Внедрение гена теломеразы (TERT), нарушение работы гена Agtr1a, нокаут GHRKO, нарушение в генах, кодирующих рецепторы к IGF-1, сверх экспрессия FGF21, нокаут AC5, удаление RIP3, редактирование гена PCSK9, сверх экспрессия Klotho, нокаут RAGE, сверх экспрессия BubR1, сверх экспрессия MTH1 - всё это примеры самых эффективных способов генной инженерии или генной терапии, позволяющих продлевать жизнь животным.
4. Чтобы добиться более существенных результатов в генной терапии старения и в генной инженерии против старения, необходимо комбинировать разные подходы. Добавить метки
Сегодня наконец-то генная терапия начинает оправдывать надежды, когда-то на нее возлагавшиеся. В последние шесть лет в результате введения специфических функциональных генов в части тела пациента удалось восстановить зрение у 40 больных с наследственной слепотой. Достигнуты блестящие результаты в борьбе с различными формами лейкоза: из 120 испытуемых у нескольких больных достигнута ремиссия, длящаяся уже три года. Генная терапия показала свою результативность и в борьбе с гемофилией - наследственным заболеванием, иногда приводящим к гибели пациента. Теперь больному не нужно принимать в высоких дозах препараты, повышающие свертываемость крови и обладающие опасными побочными эффектами.
Положительные результаты были встречены с большим энтузиазмом еще и потому, что на генной терапии поставили крест 15 лет назад после безвременной кончины Джесси Гелсингера (Jesse Gelsinger), подростка с редким расстройством системы пищеварения. Иммунная система молодого человека отреагировала на введение чужеродного гена так бурно, что организм не выдержал. Успехи генной терапии, достигнутые в 1990-е гг.. оказались далеко не столь впечатляющими, как ожидалось.
Все это заставило пересмотреть некоторые из применявшихся методик и более трезво оценить возможности использования генной терапии для устранения различных патологий. Пришлось расстаться с иллюзиями и вернуться к фундаментальным исследованиям. Прежде всего нужно было установить причину возможных побочных эффектов (наподобие тех, что привели к гибели Гелсингера) и научиться их избегать. Больше внимания следовало уделять общению с больными и их родственниками, чтобы принимаемое ими решение было осознанным.
Перелом в ситуации произошел шесть лет назад, после того как с помощью генной терапии удалось вылечить восьмилетнего мальчика по имени Кори Хаас (Corey Haas), страдавшего дегенеративным заболеванием глаз. Вначале в результате генных манипуляций в пораженной сетчатке левого глаза начал вырабатываться недостающий белок, и уже через четыре дня после операции мальчик побывал в зоопарке и к своему неописуемому восторгу понял, что он видит синее небо и разноцветные воздушные шарики. Через три года аналогичные манипуляции были проделаны с правым глазом. Теперь Кори видит так хорошо, что может ходить на охоту со своим дедушкой.
Пока генная терапия не вошла в арсенал практикующих врачей, но есть надежда, что в ближайшие десять лет это произойдет. В 2012 г. в Европе была предпринята попытка применить ее для устранения редкой, но чрезвычайно мучительной патологии, так называемого семейного дефицита липопротеинлипазы. Ожидается, что в США разрешение на использование генной терапии в медицине будет получено в 2016 г.. и тогда ей предстоит наверстать то, что было упущено за десять лет бездействия.
Жестокое разочарование
Неудачи, постигшие исследователей на ранних этапах применения генной терапии на практике, наглядно показали, как трудно предвидеть все последствия введения в организм чужеродных генов. Слишком часто самые безопасные системы их доставки оказывались недостаточно эффективными, а некоторые наиболее эффективные- небезопасными: возникает слишком бурная иммунная реакция, как это было в случае с Гелсингером или развивается лейкоз.
Для того чтобы понять, что становится спусковым крючком для побочных эффектов, и выяснить, как уменьшить риск их возникновения, генетики сосредоточились на тщательном изучении наиболее распространенной системы доставки генов: конструировании вирусов, действующих как микроскопический шприц для инъекций.
Прежде всего из вирусной ДНК была удалена значительная ее часть, чтобы высвободить место для генов, предназначенных для введения в организм больного. (Такая процедура одновременно лишала вирус способности к размножению.) Трансформированный вирус, несущий целевые гены, инъецировали в нужную часть тела, где он встраивал их в соответствующие области клеточной ДНК в зависимости от типа вируса.
В тот период, когда Гелсингер участвовал в качестве добровольца в клинических испытаниях генной терапии, самой распространенной системой доставки чужеродных генов в организм человека были аденовирусы, которые обычно вызывают нетяжелое инфекционное заболевание верхних дыхательных путей. По данным исследователей из Пенсильванского университета, оптимальный результат дает инъекция вируса в печень; именно здесь находятся клетки, вырабатывающие пищеварительный фермент, который отсутствовал у Гелсингера. Функциональную копию гена этого фермента ввели в инактивированную вирусную частицу и инъецировали триллион таких частиц в печень больного.
К несчастью, некоторые частицы попали не только в клетки печени, как им полагалось, но и в огромное количество макрофагов- крупных клеток, «сторожевых» иммунной системы, а также в дендритные клетки, оповещающие последнюю о вторжении чужеродных агентов. Иммунная система немедленно начала разрушать все инфицированные клетки, и этот бурный процесс в конце концов погубил больного.
Жесткость иммунного ответа поразила исследователей. Ни у одного из 17 других добровольцев ничего подобного не наблюдалось. Было известно, что аденовирус может вызывать иммунную реакцию, но если не считать инцидента с одной обезьяной, которой инъецировали аденовирус, немного отличающийся от описанного выше, то случай с Гелсингером был уникальным. «Человеческая популяция намного более гетерогенна, чем популяция животных, - говорит Джеймс Уилсон (James Wilson) из Пенсильванского университета, разработавший систему доставки целевых генов, которую и использовали в клинических испытаниях с участием Гелсингера.- И в нашем случае один больной в чем-то существенно отличался от остальных». Возможно, трагедии не произошло бы, если бы доза вируса была меньше - не триллион частиц, а несколько миллиардов. Еще один недочет заключался в том, что ни сам больной, ни его родственники не были проинформированы о гибели обезьяны в аналогичных испытаниях, и никто не знал, какое решение они бы приняли, если бы знали об инциденте.
Трагедия, произошедшая с Гелсингером не была последней. Вскоре была предпринята попытка устранить с помощью генной терапии другую патологию - тяжелый комбинированный иммунодефицит XI (SCID-X1). В испытаниях участвовали 20 детей; у пяти из них развился лейкоз, один ребенок умер. И опять виновата была система доставки, хотя в данном случае использовался другой вектор - ретровирус, встраивающий целевые гены непосредственно в клеточную ДНК. Точное их положение в геноме немного варьирует, и иногда они включаются вблизи онкогена, что при определенных условиях приводит к возникновению рака.
Пересмотр технологии
Трагические последствия применения ретро- и аденовирусов в качестве векторов заставили обратиться к другим переносчикам. В результате были выбраны два вируса.
Первый из них, аденоассоциированный вирус (AAV), не вызывает у человека никаких инфекций. Большинство из нас в тот или иной период своей жизни становятся его носителями, и именно благодаря этому на него вряд ли отреагирует иммунная система, когда он будет выполнять функцию вектора. У AAVесть еще одна особенность, помогающая минимизировать риск побочных эффектов: он представлен множеством разновидностей (серотипов), каждый из которых предпочитает инфицировать клетки «своего» органа или ткани. Так, для AAV2 это глаза, для AAV8- печень, для AAV9- сердечная мышца и мозг. Можно выбрать разновидность вируса, оптимальную для целевой части тела, и минимизировать иммунный ответ и другие нежелательные эффекты. Кроме того, AAVue включает свой генетический материал в геном клетки-хозяина, а потому не может вызвать рак, случайным образом активировав онкогены.
Аденоассоциированный вирус впервые проходил тестирование на способность доставлять генетический материал в нужные ткани в 1996 г. Испытания проводились на добровольцах, страдающих муковисцидозом. С тех пор было идентифицировано 11 серотипов данного вируса, а из их компонентов сконструированы сотни безопасных, селективно действующих векторов. Сейчас проходят испытания переносчики на основе AAV-вирусов для применения генной терапии при таких патологиях, как болезни Паркинсона и Альцгеймера, а также при гемофилии, мышечной дистрофии, сердечной недостаточности и слепоте.
Второй вирус, как ни удивительно, - ослабленный вариант вируса иммунодефицита человека, возбудителя СПИДа. Забудем на время о его плохой репутации и остановимся на его преимуществах как вектора. ВИЧ - член рода Lentivirus семейства рстровирусов. Он поражает клетки иммунной системы и - что очень важно - не активирует онкогены.
Если удалить гены, отвечающие за летальное действие ВИЧ, то мы получим превосходный вектор с широкими возможностями. Так считает Стюарт Нейлор (Stuart Naylor), бывший научный руководитель английской компании Oxford Biomedica. В отличие от более мелкого AAV, «обезвреженный» ВИЧ пригоден для переноса сразу нескольких генов. Он нетоксичен и не вызывает иммунной реакции. Лишенные способности вызывать инфекцию лентивирусы проходят тестирование на возможность применения для устранения различных патологий, в частности аденолейкодистрофии. На сегодня уже несколько мальчиков с таким диагнозом благодаря генной терапии смогли вернуться в школу.
Параллельно с клиническими испытаниями с применением AAVn ВИЧ ведется работа по модификации старых вирусных векторов с тем, чтобы их можно было использовать при определенных обстоятельствах. Так, ретровирусы (за исключением ВИЧ) генетически модифицируют, чтобы они не вызывали лейкоза.
Не отвергнут окончательно даже аденовирус, применение которого привело к гибели Гелсингера. Его вводят теперь только в те части тела, где он вряд ли вызовет иммунную реакцию. Одно из возможных его применений - генная терапия ксеротомии (сухости во рту) у пациентов, подвергавшихся облучению в связи с раком областей головы и шеи. при котором повреждаются слюнные железы.
Национальные институты здравоохранения проводят клиническое испытание (с привлечением небольшого числа добровольцев) подхода, основанного на введении в соответствующие клетки генов, опосредующих образование каналов для прохождения воды в слюнные железы. Поскольку последние невелики по размерам и более или менее изолированы, а доза вируса в 1 тыс. раз меньше той, что когда-то получил Гелсингер, вероятность излишне сильной иммунной реакции сведена к минимуму. Вирусные частицы, не достигшие клеток-мишеней, по мнению разработчиков, должны разрушаться в слюне, выплевываться вместе с ней либо проглатываться, что опять-таки уменьшает риск развития иммунной реакции. За период с 2006 г. таким способом удалось существенно улучшить состояние 11 пациентов.
Новые мишени
Воодушевленные успехом, медицинские генетики расширили область применения генной терапии и попытались с ее помощью устранять генетические дефекты ненаследственного характера.
Так, в Пенсильванском университете уже используют этот подход в борьбе с одним из наиболее часто встречающихся у детей онкологических заболеваний - острым лимфобластным лейкозом (ALL). Примерно 20% детей с таким диагнозом традиционная химиотерапия не помогает.
Генная терапия в таких случаях особенно сложна и основывается на применении химерных рецепторов антигенов (CAR). Подобно химерам из древнегреческой мифологии, состоящим из частей тела разных животных, эти рецепторы представляют собой комплекс из двух компонентов иммунной системы, в норме в организме не встречающийся. Т-клетки, к которым его присоединяют, приобретают способность отыскивать специфические белки, содержащиеся в лейкозных клетках в большем количестве, чем в нормальных, и разрушать аномальные клетки. Первыми испытуемыми были взрослые пациенты с хроническим лейкозом: полученные результаты внушали оптимизм. Исход испытаний на больных детях превзошел все ожидания.
Когда в мае 2010 г. у Эмили Уайтхед (Emily Whitehead) обнаружили лейкоз, ей было девять лет. Два курса химиотерапии результата не дали. Весной 2012 г. провели третий курс, который мог бы убить взрослого, но девочка выжила, хотя у нее возникли нарушения в почках, печени и селезенке. По словам лечащего врача Брюса Левина (Bruce Levine). «Эмили была на волосок от смерти».
Тогда у нее взяли кровь, выделили Т-клетки и ввели в них лентивирус. в геном которого предварительно включили целевые гены. После инъекции химерных Т-клеток обратно в организм пациентки ее состояние стало быстро улучшаться. Через три недели 25% Т-клеток ее костного мозга были генетически модифицированы и начали «охоту» на раковые клетки. «В апреле девочка полностью облысела. - вспоминает Левин, - а к августу приобрела прежний облик и была готова к школе».
Модифицированные Т-клетки вряд ли будут работать до конца ее жизни, но процедуру всегда можно повторить. А пока эта симпатичная девочка с густыми каштановыми волосами избавлена от раковых клеток. Осенью 2013 г. сразу несколько групп медицинских генетиков сообщили об использовании CAR-методики для лечения 120 больных с той же формой лейкоза, что у Эмили Уайтхед, а также с другими формами. У пятерых взрослых и 19 из 22 детей наступила ремиссия.
Перспективы
Теперь перед специалистами по генной терапии стоит очередная задача: им нужно получить разрешение Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов (FDA) на применение своей более безопасной, чем все прежние, векторной системы в клинике. Необходимо организовать III фазу клинических испытаний с участием большой группы добровольцев. Обычно на это уходит от одного года до пяти лет. По состоянию на конец 2013 г. примерно 5% из 2 тыс. испытаний дошли до этой фазы. Дальше других продвинулись создатели методики лечения с помощью генной терапии пациентов, страдающих болезнью Лебера (двусторонней потерей зрения, обусловленной мутацией в митохондриальной ДНК: данная патология была у восьмилетнего Хааса). Уже нескольким десяткам больных удалось вернуть зрение с помощью генной терапии.
Генная терапия
Баранов В.С. Генная терапия – медицина XXI века // Соросовский образовательный журнал. – 1999. – № 3. – С. 63–68. (Санкт-Петербургский государственный университет)
© Баранов В.С., текст
© Соросовский образовательный журнал, 1999
© А. Афонин, обработка и публикация html-версии, 2006
<http :// afonin -59- bio . narod . ru >
<http :// afonin -59- salix . narod . ru >
ВВЕДЕНИЕ
Решающие достижения молекулярной биологии и генетики в изучении тонкой структуры генов эукариот, их картировании на хромосомах млекопитающих, и прежде всего человека, впечатляющие успехи проекта "Геном человека" в идентификации и клонировании генов, мутации которых приводят к многочисленным наследственным болезням, и, наконец, бурный рост в области биотехнологии и генной инженерии явились необходимыми предпосылками для того, чтобы от опытов на животных и теоретических построений уже в 1989 году предпринять первые попытки лечения моногенных болезней.
Что же такое генная терапия? Подразумевает ли она лечение с помощью гена как лекарственного препарата или только лечение путем коррекции мутантного гена? Эти и многие другие вопросы неминуемо возникают при рассмотрении такого многообещающего, а возможно, и потенциально опасного для человечества направления медицины грядущего XXI века, как генная терапия.
КРАТКАЯ ИСТОРИЧЕСКАЯ СПРАВКА
Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, мультифакториальных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы. Первым моногенным наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался наследственный иммунодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA ). 14 сентября 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей этим достаточно редким заболеванием (1:100000), были пересажены ее собственные лимфоциты, предварительно трансформированные вне организма (ex vivo ) геном ADA (ген ADA + ген пео + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедура была повторена с интервалом 3…5 месяцев. За три года терапии в общей сложности проведены 23 внутривенные трансфузии ADA - трансформированных Т-лимфоцитов без видимых неблагоприятных эффектов. В результате лечения состояние пациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций. Столь же успешным оказалось и лечение второй пациентки с этим заболеванием. В настоящее время клинические испытания генной терапии этого заболевания проводятся в Италии, Франции, Великобритании и Японии.
В 1997 году число допущенных к клиническим испытаниям протоколов уже составляло 175, более 2000 пациентов приняли участие в их реализации . Большинство таких проектов (около 80%) касаются лечения онкологических заболеваний, а также ВИЧ-инфекции (СПИДа). Вместе с тем и в современных исследованиях по генной терапии необходимо учитывать, что последствия манипулирования генами или рекомбинантными ДНК in vivo изучены недостаточно.
В странах с наиболее продвинутым уровнем исследований в этой области, особенно в США, медицинские протоколы с использованием смысловых последовательностей ДНК подвергаются обязательной экспертизе в соответствующих комитетах и комиссиях. В США таковыми являются Консультативный комитет по рекомбинантным ДНК (Recombinant DNA Advisory Committee, RAC) и Управление по лекарствам и пищевым продуктам (Food and DrugAdministration, FDA) с последующим обязательным утверждением проекта директором Национальных институтов здоровья (National Institutes of Health). В Европе такие протоколы составляют и утверждают в соответствии с рекомендациями Европейской рабочей группы по переносу генов и генной терапии (European Working Group on HumanGene Transfer and Therapy).
МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФЕКЦИИ В ГЕННОЙ ТЕРАПИИ
Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии). Трансфекция может проводиться с использованием чистой ("голой" - naked) ДНК, легированной (встроенной) в соответствующую плазмиду, или комплексированной ДНК (плазмидная ДНК, соединенная с солями, белками (трансферрин), органическими полимерами (DEAE-декстран, полилизин, липосомами или частицами золота), или ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишенных способности к репликации.
Основные методы доставки чужеродных генов в клетки разделяются на химические, физические и биологические. Эффективность трансфекции и интеграционная способность трансдуцированной чужеродной ДНК при различных способах трансфекции в ДНК-клетки мишени неодинакова. Только вирусные векторы или генетические конструкции, включающие вирусные последовательности, способны к активной трансдукции, а в некоторых случаях и к длительной экспрессии чужеродных генов. Из более 175 уже одобренных протоколов клинических испытаний по генотерапии более 120 предполагают использовать вирусную трансдукцию и около 100 из них основаны на применении ретровирусных векторов.
Обзор данных позволяет прийти к заключению, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все уже известные и испытанные in vivo и in vitro векторные системы далеки от совершенства. Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем – стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность – все еще нуждаются в серьезных доработках.
Прежде всего это касается стабильности интеграции. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем, либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительной персистенции внутри ядер).
Рецептор-опосредованный перенос генов заключается в следующем. ДНК-последовательность нужного гена соединяют с определенным веществом (например, гликопротеином), который обладает высоким сродством к определенному мембранному рецептору трансформируемой клетки (например, гепатоцита). Полученный комплекс соединяют с аденовирусом, обеспечивающим проникновение генной конструкции в ядро клетки. Такой комбинированный вектор обеспечивает эффективную адресную доставку гена в определенные клетки.
В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (Mammalian Artificial Chromosomes). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время.
ПРИНЦИПЫ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ
В зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная терапия может проводиться либо в культуре клеток (ех vivo), либо непосредственно в организме (in vivo ). Клеточная генная терапия или терапия ех vivo предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента in vitro , введение в них чужеродных генов (например, усиливающих иммунный ответ организма), отбор трансфецированных клонов клеток и реинфузию (введение) их тому же пациенту. В настоящее время в большинстве допущенных к клиническим испытаниям программ генной терапии используется именно этот подход.
Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. Особенно перспективным для лечения генных болезней invivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний (муковисцидоз, рак легких).
Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена, идентификация первичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола. Апробацию процедуры генокоррекции наследственного заболевания проводят на первичных культурах клеток больного, в которых в норме функционально активен данный ген. На этих клеточных моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клетки, отрабатывают способы коррекции на биохимическом уровне.
Используя культуры клеток, можно разработать систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако проверка надежности работы этой системы может быть осуществлена только на уровне целого организма. Поэтому такое внимание в программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo на естественных или искусственно полученных моделях соответствующих наследственных болезней у животных. Успешная коррекция генетических дефектов у таких животных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной терапии являются важнейшей предпосылкой для разрешения клинических испытаний.
Таким образом, стандартная схема генокоррекции наследственного дефекта включает серию последовательных этапов. Она начинается созданием полноценно работающей (экспрессирующейся) генетической конструкции, содержащей смысловую (кодирующую белок) и регуляторную части гена. На следующем этапе решается проблема вектора, обеспечивающего эффективную, а по возможности и адресную доставку гена в клетки-мишени. Затем проводится трансфекция (перенос полученной конструкции) в клетки-мишени, оценивается эффективность трансфекции, степень коррегируемости первичного биохимического дефекта в условиях клеточных культур (in vitro ) и, что особенно важно, in vivo на животных - биологических моделях. Только после этого можно приступать к программе клинических испытаний.
ГЕНОТЕРАПИЯ МОНОГЕННЫХ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Успех первых клинических испытаний явился мощным стимулом для ускорения развития новых генотерапевтических методов применительно к другим наследственным болезням. Ниже приведен список болезней, для которых принципиально возможен генотерапевтический подход, генокоррекция которых с большой вероятностью будет осуществлена уже в обозримом будущем, а также те заболевания, для которых уже имеются официально утвержденные протоколы и которые находятся на разных стадиях клинических испытаний.
Таблица 1 – Наследственные заболевания, генокоррекция которых находится на стадии клинических испытаний (КИ), экспериментальных разработок (ЭР) и принципиально возможна (ПВ)
|
Болезнь |
Дефектный ген |
Клетки-мишени |
Стадия |
|
Иммунодефицит |
Аденозиндезаминаза |
Лимфоциты | |
|
Иммунодефицит |
Пуриннуклеозидфосфорилаза |
Лимфоциты | |
|
Семейная гиперхолестеринемия |
Рецептор липопротеинов низкой плотности |
Гепатоциты | |
|
Гемофилия В |
Фактор IX |
Фибробласты | |
|
Гемофилия А |
Фактор VIII |
Миобласты, фибробласты | |
|
Болезнь Гоше (сфинголипидоз) |
р-Глюкоцереброзидаза |
Макрофаги, стволовые клетки | |
|
Болезнь Хантера |
Идуронатсульфатаза |
Макрофаги, стволовые клетки | |
|
Синдром Гурлера |
L-идуронидаза |
Макрофаги, стволовые клетки | |
|
Эмфизема легких |
α -1 -Антитрипсин |
Лимфоциты | |
|
Муковисцидоз |
СГ-трансмембранный регулятор |
Эпителий бронхов | |
|
Фенилкетонурия |
Фенилаланингидроксилаза |
Гепатоциты | |
|
Гипераммонемия |
Орнитинтранскарбамилаза |
Гепатоциты | |
|
Цитрулинемия |
Аргиносукцинатсинтетаза |
Гепатоциты | |
|
Мышечная дистрофия Дюшенна |
Дистрофии |
Миобласты, миофибриллы | |
|
Талассемия |
β -Глобин |
Эритробласты | |
|
Серповидноклеточная анемия |
β -Глобин |
Эритробласты | |
|
Респираторный дистресс-синдром |
Сурфактант белок В |
Эпителий бронхов | |
|
Хронический грануломатоз |
NADPH-оксидаза |
Гранулоциты | |
|
Болезнь Альцгеймера |
Белок – предшественник β-амилоида (ААР) |
Нервные клетки | |
|
Болезнь Паркинсона |
Тирозингидроксилаза |
Миобласты, фибробласты, нервные клетки | |
|
Метахроматическая лекодистрофия |
Арилсульфатаза А |
Стволовые клетки крови, нервные клетки | |
|
Синдром Леш-Нихана |
Гипоксантинфосфорибозилтрансфераза |
Нервные клетки |
ГЕНОТЕРАПИЯ НЕНАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Одновременно с развитием исследований в области генокоррекции наследственных дефектов успешными также оказались поиски методов терапевтического использования смысловых последовательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний, и главным образом злокачественных опухолей и вирусных инфекций. Существенно, что именно в этих разделах патологии поиски путей генокоррекции проводятся особенно интенсивно, а число уже одобренных протоколов клинических испытаний во много раз превышает число таковых для лечения моногенных болезней.
Ниже перечислены основные методологические подходы к генотерапии различных опухолей, разработанные и уже широко используемые. Многие из этих подходов вполне приложимы и для борьбы с наиболее серьезными инфекционными заболеваниями, например с ВИЧ-инфекцией (СПИДом).
Результаты первых клинических испытаний этих подходов оказались в высшей степени обнадеживающими, в особенности при лечении нейродегенеративных и онкологических заболеваний нервной системы.
Таблица 2 – Основные подходы в генокоррекции онкологических заболеваний
|
Вводимые гены |
|
|
Повышение иммунореактивности опухоли |
Гены чужеродных антигенов, цитокинов |
|
Генетическая модификация иммунных клеток |
Гены цитокинов, костимуляторов |
|
Инсерция генов "чувствительности" либо генов"-самоубийц" |
Гены тимидинкиназы HSV, цитозин дезаминазы |
|
Блок экспрессии онкогенов |
Антисмысловые Ki-ras мРНК, гены внутриклеточных антител |
|
Инсерция генов-супрессоров опухолей | |
|
Защита нормальных клеток от химиотерапии |
Гены лекарственной устойчивости тип 1 |
|
Индукция синтеза противоопухолевых веществ нормальными клетками |
Гены интерлейкина-2, интерферона |
|
Продукция противоопухолевых рекомбинантных вакцин |
Вакцины типа БЦЖ, экспрессирующий опухолевый антиген |
|
Локальная радиопротекция нормальных тканей с помощью антиоксидантов |
Гены трансферазы, глутатион синтетазы |
НЕКОТОРЫЕ ЭТИЧЕСКИЕ И СОЦИАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ
ГЕННОЙ ТЕРАПИИ
Появление принципиально новых технологий, позволяющих активно манипулировать с генами и их фрагментами и обеспечивающих адресную доставку новых блоков генетической информации в заданные участки генома, стало важным событием в биологии и медицине.
Уже сейчас на современном уровне знаний о геноме человека теоретически вполне возможны такие его модификации с целью улучшения некоторых физических (например, рост), психических и интеллектуальных параметров. Таким образом, современная наука о человеке на своем новом витке развития вернулась к идее улучшения человеческой породы, когда-то постулированной выдающимся английским генетиком Ф. Гальтоном и развитой его учениками и последователями в Великобритании (К. Пирсон, Л. Пенроуз, Дж. Холдейн), в России (Н.К. Кольцов, Ф.П. Филипченко), в США (Г. Мёллер). Дальнейший ход истории, как известно, полностью дискредитировал саму идею улучшения человеческой породы. Однако грядущее всевластие человека над собственным геномом заставляет вновь и вновь возвращаться к этой теме, делает ее предметом постоянных оживленных дискуссий в широкой и научной печати. Не вызывает сомнения, что первоначальные опасения, связанные с генной инженерией человека, были неоправданны. Уже признано целесообразным применение генной терапии для лечения многих заболеваний. Единственным и непременным ограничением, сохраняющим свою силу и в современных условиях, является то, что все генотерапевтические мероприятия должны быть направлены только на конкретного больного и касаться исключительно его соматических клеток.
Современный уровень знаний не позволяет проводить коррекцию генных дефектов на уровне половых клеток и клеток ранних доимплантационных зародышей человека в связи с реальной опасностью засорения генофонда нежелательными искусственными генными конструкциями или внесением мутаций с непредсказуемыми последствиями для будущего человечества. Вместе с тем в научной литературе все чаще и настойчивее раздаются призывы к возобновлению дискуссии о целесообразности генокоррекции зародышевых и половых клеток человека.
Вот некоторые вопросы, которые должны быть решены в рамках предлагаемой генетиками широкой дискуссии по генной терапии.
1. Сможет ли в будущем генная терапия обеспечить столь полноценную генокоррекцию, которая не представит угрозы для потомства?
2. В какой мере полезность и необходимость генотерапевтической процедуры для одной супружеской четы перевесят риск такого вмешательства для всего человечества?
3. Сколь оправданны будут эти процедуры на фоне грядущего перенаселения планеты?
4. Как будут соотноситься генноинженерные мероприятия на человеке с проблемами гомеостаза общества и биосферы?
Таким образом, генетическая революция, апофеозом которой явилась генотерапия, не только предлагает реальные пути лечения тяжелых наследственных и ненаследственных недугов, но и в своем стремительном развитии ставит перед обществом новые проблемы, решение которых настоятельно необходимо уже в ближайшем будущем.
Здоровье
Концепция замены дефективных генов здоровыми, которая стала активно приобретать научную оболочку еще в начале девяностых годов прошлого века , казалось, подарит надежду самым безнадежным больным. Однако с момента первого эксперимента по генной терапии, осуществленном в 1990-ом году, оптимизма у ученых несколько поубавилось – и все из-за определенных неудач и трудностей в реализации методов генной терапии. Однако возможности, которые предлагает генная терапия для лечения болезни Паркинсона, кистозного фиброза, различных видов рака, и многих других заболеваний, поистине безграничны. Именно поэтому ученые трудятся не покладая рук , стараясь преодолеть все возникающие у них на пути трудности, связанные с генотерапией.
Что такое генотерапия?
Так чем же является генная терапия на самом деле? Для того, чтобы ответить на данный вопрос, необходимо напомнить, что основной функцией генов в нашем организме является регулирование производства белков , необходимых для нормальной работы и здоровья всех клеток. Но некоторые генетические дефекты (изъяны в генах) мешают выполнению их главной функции, в той или иной степени препятствуя выработке белков. Целью же генной терапии (генотерапии) является замена дефективных генов здоровыми . Это поможет наладить воспроизводство соответствующего белка, а значит, человек будет излечен от определенной болезни.
Если рассматривать идеальный сценарий развития, клетки с подкорректированными молекулами дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) начнут делиться, производя, в свою очередь, множественные копии исправленного гена, что позволит организму избавиться от генетической аномалии и полностью излечиться. Однако введение здоровых генов в больные клетки (как и попытки исправить соответствующие отклонения) является крайне сложным процессом, который пока крайне редко приводил к успеху . Именно поэтому большинство современных исследований направлено на разработку безопасных и надежных механизмов введения генов в поврежденные клетки.
Виды генной терапии: терапия ex vivo и in vivo
Генная терапия, в зависимости от способа введения ДНК в геном пациента, может осуществляться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo)
. В случае с генной терапией ex vivo, клетки изымаются из организма пациента, генетически модифицируются, а затем вводятся обратно в организм индивидуума. Этот метод особенно полезен в лечении заболеваний крови, так как клетки крови можно довольно легко изъять и ввести обратно. Однако в случае с большинством других заболеваний, изъять клетки из организма и ввести обратно далеко не так просто. К примеру, в случае с заболеваниями сердца, обусловленными генетическими причинами
, эффективным мероприятием является так называемая генная терапия in vivo, когда изменения генов осуществляются непосредственно в организме пациента. Для того чтобы проделать данную процедуру, генетическая информация доставляется непосредственно в клетку посредством вектора – молекулы нуклеиновой кислоты, используемой в генной инженерии для передачи генетического материала
. В большинстве случаев, для того чтобы осуществить эту передачу, исследователи используют не опасные для здоровья и жизни вирусы.
Способы доставки в клетку генетической информации
Как показывают многочисленные исследования, использование различных вирусов является весьма эффективным решением, которое позволяет пробраться через имунную защиту организма , а затем инфицировать клетки, используя их для распространения вируса. Для осуществления данной процедуры, генные инженеры выбрали наиболее подходящие вирусы из группы ретровирусов и аденовирусов. Ретровирусы привносят генетическую информацию в виде рибонуклеиновой кислоты (РНК), молекулы, похожей на молекулу ДНК, которая помогает перерабатывать генетическую информацию, сохраненную в ДНК. Как только удается проникнуть вглубь так называемой клетки-мишени, из молекулы РНК получается копия молекулы ДНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией. Как только новая молекула ДНК оказывается присоединенной к клетке, все новые копии клеток будут содержать этот модифицированный ген.
Аденовирусы несут генетическую информацию сразу в виде ДНК, который доставляется в неделящуюся клетку. Хотя эти вирусы доставляют ДНК непосредственно в ядро клетки-мишени , ДНК не совмещается с геномом клетки. Таким образом, модифицированный ген и генетическая информация не передаются дочерним клеткам. Преимуществом генной терапии, проводимой с помощью аденовирусов, заключается в том, что существует возможность введения генов в клетки нервной системы и в слизистую оболочку дыхательных путей, опять же, посредством вектора. Кроме того, существует и третий метод генной терапии, осуществляемый посредством так называемых аденоассоциированных вирусов. Эти вирусы содержат относительно небольшое количество генетической информации , и их гораздо сложнее вывести, чем ретровирусы и аденовирусы. Однако преимущество аденоассоциированных вирусов заключается в том, что они не вызывают реакции иммунной системы человека.
Сложности, при использовании вирусов в генной терапии
Главная проблема, которая связана со способом доставки генетической информации в клетку посредством вирусов, заключается в том, что полностью проконтролировать соединение генов с клеткой-мишенью чрезвычайно сложно
. Это может быть крайне опасно, так как не исключена так называемая экспрессия генов, которая способна превратить здоровые клетки в раковые. На данный момент времени, эта проблема является особенно насущной в работе с ретровирусами. Вторая проблема, решение которой пока невозможно организовать
, заключается в том, что одной процедуры применения генной терапии, чаще всего, бывает недостаточно. Большинство генетических терапий необходимо время от времени повторять. И, в третьих, использование вирусов для доставки генетической информации в клетку, осложняется риском возникновения реакции иммунной системы организма. Это также является крайне серьезной проблемой, особенно в тех случаях, когда требуется неоднократное повторение процедуры генной терапии
, так как организм пациента постепенно адаптируется и начинает все эффективнее бороться с вводимыми вирусами.
Генная терапия: исследования продолжаются
Если говорить об успехах, то на данный момент времени генетическая терапия является крайне эффективным мероприятием в лечении так называемого комбинированного иммунодефицита , сцепленного с X-хромосомой ген. С другой стороны, случаев успешного использования генотерапии для лечения данной болезни крайне мало. Кроме того, само лечение представляет собой рискованное мероприятие, так как способно вызвать у пациентов ряд симптомов, которые встречаются у людей, страдающих от лейкемии. Помимо данного заболевания, случаев использования генной терапии, которые были бы так же эффективны, очень и очень мало, хотя последние исследования и дают надежду на скорое использование генотерапии для лечения больных, страдающих от артрита, рака мозга, серповидно-клеточной анемии, расщелины сетчатки и от некоторых других состояний.
Получается, что о практическом применении генной терапии в медицине говорить еще очень рано. Тем не менее, исследователи продолжают искать способы безопасного и эффективного использования генной терапии , проведя большую часть экспериментов в живой ткани, перенесенной из организма в искусственную внешнюю среду. Среди этих экспериментов крайне интересными представляются исследования, в рамках которых ученые пытаются ввести в клетку-мишень искусственную, 47-ю хромосому. Недавние научные изыскания позволили ученым лучше разобраться в процессах, происходящих при внедрении молекулы РНК . Это позволило разработать механизм подавления транскрипции гена (так называемое выключение гена), который, возможно, принесет пользу в лечении болезни Гамильтона. Ученые сообщают также о том, что им удалось разработать способ доставки генетической информации в клетки мозга, чего раньше нельзя было осуществить с помощью вектора, так как данная молекула была чересчур велика для этой цели . Иными словами, исследования продолжаются, а это значит, что у человечества есть все шансы научиться бороться с заболеваниями посредством использования методов генной терапии.